劉中洪，馮家龍，蔣 濤，冉春雷

(武警重慶市總隊醫(yī)院神經(jīng)外科，重慶 400061)

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)對神經(jīng)細胞的損傷分原發(fā)性和繼發(fā)性兩種，細胞凋亡是繼發(fā)性損傷的一種重要細胞死亡方式，它是由一系列基因控制的遲發(fā)性神經(jīng)元死亡，對繼發(fā)性腦損傷起著重要的作用，并直接影響TBI的預后。血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)是血紅素代謝的一個關(guān)鍵酶及限速酶，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡及神經(jīng)保護作用。為深入研究HO-1對腦外傷后腦組織的保護作用，本實驗觀察大鼠腦外傷HO-1對神經(jīng)細胞凋亡是否有抑制作用，以期為臨床顱腦外傷開辟新的治療途徑。

1 材料與方法

1.1材料 血晶素(hemin)、鋅原卟啉(ZnPP)購自Sigma公司，牙托粉、牙托水、多聚甲醛等常規(guī)試劑購自重慶試劑公司，兔抗HO-1(1抗)、抗凋亡蛋白(Bcl-2)(1抗)、ABC試劑盒均購自南京博士德生物公司。TUNEL法凋亡檢測試劑盒購于Boehringer公司，液壓傷模型采用Dixon裝置。

1.2方法

1.2.1復制動物模型及取材 實驗動物及分組：72只雄性SD大鼠購自第三軍醫(yī)大學實驗動物中心，體質(zhì)量280～300 g，采用隨機數(shù)字表完全隨機分為血晶素組、生理鹽水組和鋅原卟啉組各24只，然后再將每組動物又隨機分為灌注組和非灌注組。采用液壓傷復制腦外傷動物模型，動物致傷后按45 mg/100 mg體質(zhì)量腹腔注射血晶素，生理鹽水和鋅原卟啉按同樣量注射。傷后每天注射1次，喂養(yǎng)72 h后處死。切取以損傷灶為中心前后5 mm的大腦冠狀切面，固定24 h后，做冰凍切片行SP免疫組織化學及TUNEL染色。

1.2.2腦組織免疫組織化學檢測HO-1和Bcl-2的表達 灌注組取標本前進行腦灌注固定，斷頭取腦組織，繼續(xù)在4%多聚甲醛中固定6 h以上。然后在30%的蔗糖多聚甲醛液里脫水。作冰凍切片進行免疫組織化學觀察HO-1和Bcl-2的表達情況，具體操作按試劑盒說明進行。每只動物觀察受傷周圍5個視野，計數(shù)陽性細胞，然后求平均值，作為每個動物的HO-1和Bcl-2陽性細胞數(shù)。

1.2.3神經(jīng)細胞凋亡檢測 按照TUNEL凋亡細胞檢測試劑盒說明書操作。細胞核中有綠色熒光者為陽性細胞，即凋亡細胞，每組選5張切片，每張切片在腦損傷側(cè)皮層計數(shù)5個不重疊視野，計數(shù)100個神經(jīng)細胞中的凋亡細胞，取平均值，為該切片凋亡指數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1HO-1、Bcl-2的表達和凋亡指數(shù)的比較 見表1。

2.2HO-1的表達 通過計數(shù)相同視野、相同部位的血紅素氧合酶陽性細胞數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，誘導劑血晶素組血紅素氧合酶陽性細胞數(shù)較生理鹽水組及鋅原卟啉組顯著增加(P<0.01)。抑制劑鋅原卟啉組血紅素氧合酶陽性細胞數(shù)較生理鹽水組顯著減少，提示對血紅素氧合酶表達的干預比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表1 HO-1、Bcl-2的表達和凋亡指數(shù)的比較

2.3Bcl-2的表達 通過計數(shù)相同視野、相同部位的Bcl-2陽性細胞數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，誘導劑血晶素組Bcl-2陽性細胞數(shù)較生理鹽水組及鋅原卟啉組顯著增加(P<0.01)。抑制劑鋅原卟啉組Bcl-2陽性細胞數(shù)較生理鹽水組顯著減少，提示對血紅素氧合酶表達的干預后，Bcl-2的表達水平比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.4細胞凋亡的檢測結(jié)果 TUNEL染色見細胞核呈綠色熒光顆粒即凋亡細胞，傷側(cè)大腦皮質(zhì)即可見凋亡細胞，分布于損傷區(qū)及周緣。HO-1誘導組細胞凋亡較生理鹽水組及鋅原卟啉組顯著減少，而HO-1抑制組細胞凋亡較生理鹽水組則顯著增多，提示對血紅素氧合酶表達的干預后，神經(jīng)細胞的凋亡比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

3 討 論

腦外傷包括一系列病理生理過程，主要是機械損傷、腦水腫、腦缺血、出血等[1]，從而伴隨血紅蛋白分解和亞鐵血紅素釋放到腦組織細胞外[2]。顱腦創(chuàng)傷所致的神經(jīng)細胞損傷主要有3種形式：(1)原發(fā)性損傷(物理性的打擊)所致的神經(jīng)細胞直接死亡；(2)傷后出血、壓迫、缺血缺氧等繼發(fā)性損傷因素所引起的神經(jīng)細胞壞死；(3)炎性介質(zhì)、細胞因子、興奮性遞質(zhì)、Ca2+超載、氧自由基等因素所誘發(fā)的神經(jīng)細胞凋亡。自1995年美國學者Rink首先證明顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)細胞存在凋亡現(xiàn)象以來，越來越多的證據(jù)表明凋亡在顱腦創(chuàng)傷所引起的神經(jīng)細胞損傷中起著重要的作用，并對其機制進行了深入的研究。急性顱腦外傷后神經(jīng)細胞常發(fā)生遲發(fā)性損傷，主要表現(xiàn)為神經(jīng)細胞凋亡。夏磊等[3]發(fā)現(xiàn)腦外傷后1 h即可出現(xiàn)神經(jīng)細胞凋亡。細胞凋亡過程受到嚴格的基因調(diào)控。Bcl-2基因是目前公認的內(nèi)源性抗凋亡因子[4]，它對維持顱腦損傷后神經(jīng)細胞的生存具有重要作用，并且不同的干預和刺激可上調(diào)Bcl-2 mRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達及其蛋白合成，抑制神經(jīng)細胞凋亡，促進軸突再生，從而提高神經(jīng)細胞的存活能力。其機制可能通過抑制Bax的促凋亡作用、維持細胞鈣穩(wěn)定、抑制細胞色素C進入細胞質(zhì)等，最終抑制凋亡蛋白酶(caspase)激活所介導的細胞凋亡。研究表明，Bcl-2的表達能抑制多種因素誘導的細胞凋亡，抑制Bcl-2的表達具有促進凋亡的作用[5-6]。HO-1作為亞鐵血紅素代謝的關(guān)鍵酶，HO-1在細胞抗氧化應激損傷方面起重要調(diào)節(jié)作用[7-8]。研究表明HO-1不僅能催化血紅素生成一氧化碳、鐵、膽紅素，還具有多種生物活性：抗炎、抗氧化、抗凋亡、調(diào)節(jié)微循環(huán)的作用[9-11]。同時，HO-1的抗凋亡作用也逐漸成為研究的熱點[12-14]。Botros等[12]、Imuta等[13]研究發(fā)現(xiàn)HO-1可以降低caspase的活性、促進Bcl-2的表達，從而抑制細胞凋亡。Parfenova等[15]研究也發(fā)現(xiàn)，HO-1與原癌基因Bcl-2 和p53家族的激活有關(guān)，這些基因的產(chǎn)物在細胞的凋亡中起重要作用。

本課題組采用通過干預HO-1的表達，檢測細胞凋亡指數(shù)和Bcl-2表達，觀察HO-1能否對抗腦外傷后神經(jīng)細胞凋亡。實驗結(jié)果提示，腦外傷后HO-1、Bcl-2表達，可以檢測大量凋亡細胞?？梢园l(fā)現(xiàn)不同因素的干預HO-1的表達，Bcl-2表達的表達水平隨之出現(xiàn)變化，同時改變腦組織凋亡指數(shù)，HO-1的表達越高，Bcl-2的表達也越高，大鼠的凋亡指數(shù)越低，反之亦然。由此可以推測，外傷后HO-1可能促進Bcl-2表達，從而抑制神經(jīng)細胞的凋亡，發(fā)揮對神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用。同時，在顱腦外傷后，它還可能通過減輕腦水腫、降低腦組織自由基的產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗凋亡、調(diào)節(jié)微循環(huán)的作用，從而減少神經(jīng)細胞凋亡，保護血腦屏障，改善神經(jīng)行為，最終改善腦損傷的預后。因此，在將來的顱腦外傷治療中，可以通過改變血紅素氧合酶的表達，從而改變顱腦外傷的預后，這將可能為顱腦外傷的治療提供新的思路。

[1]Chang EF,ClausCP,Vreman HJ,et al.Heme regulation in traumatic brain injury:relevance to the adult and developing brain[J].Cereb Blood Flow Metab,2005,25(11):1401-1417.

[2]Wagner KR,Sharp FR,Ardizzone TD,et al.Heme and iron metabolism:role in cerebral hemorrhage[J].Cereb Blood Flow Metab,2003,23(4):629-633.

[3]夏磊，姜正林，王國華，等.人參總皂苷對大鼠腦外傷后神經(jīng)細胞凋亡的影響[J].中華神經(jīng)醫(yī)學雜志，2010,9(9)：888-892.

[4]Tsujimoto Y.Cell death:regliationg by the Bcl-2 protein family[J].Psychogeriarics,2006,6(1):64-70.

[5]陳江利，劉偉國，方乃成，等.大鼠腦外傷后神經(jīng)細胞凋亡與Bcl-2蛋白的關(guān)系[J].浙江創(chuàng)傷外科，2006,11(5):377-379.

[6]Reed JC.Proapoptotic multidomain Bcl-2/Bax-family ptoteins:mechanism,physiological roles,and therapeu ic opportunities[J].Cell Death Differ,2006,13(8):1378-1386.

[7]Liu X，Wei J，Peng DH，et al．Absence of heme oxygenase-1 exacerbates myocardial ischemia/reperfusion injury in diabetic mice[J]．Diabetes，2005，54(5)：778-784.

[8]Takahashi T，Morita K，Akagi R，et al.Protective role of heine oxygenase-1 in renal ischemia[J]．Antioxid Redox Signal，2004，6(6)：867-877.

[9]Aequaviva R，Campisi A，Raeiti G，et al.Propofol inhibits Caspase-3 in astroglial cells：role of heme oxyenase-1[J]．Curt Neurovasc Res，2005，2(2)：141-148.

[10]Volti GL，Sacerdoti D，Sangras B，et al.Carbon monoxide signaling in promoting angiogenesis in human mierovessel endothelial cells[J]．Antioxid Redox Signal，2005,7(6)：704-711.

[11]Abraham NG，Kappas A．Heme oxygenase and the cardiovaularrenal system[J]．Free Radle Biol Med，2005，39(1)：1-8.

[12]Botros FT,Olszanecki R,Prietocarrasquero MC,et al.Induction of heme oxygenase-1 in renovascular hyptertension is associated with inhibition of apoptosis[J]．Cell Mol Biol(Noisy-le-grand)，2007，53(1)：51-60.

[13]ImutaN,HoriO,kitaoY,etal.Hypoxia-

mediated induction of heme oxygenase type Ⅰ and carbon monoxide release from astrocytes protects nearby cerebral neurons from hypoxia-mediated apoptosis[J].Antioxid Redox Signal，2007，9(5)：543-552.

[14]Choi BM,Lim DW,Lee JA,et al.Luteolin suppresses cisplatin induced apoptosis in auditory cells:possible mediation through induction of heme oxygenase-1 expression[J]．J Med Food，2008，11(2)：230-236.

[15]Parfenova H,Basuroy S,Raymond F,et al.Glutamate induces oidative stress and apoposis in cerebral vascular endothelial cell:contribution of HO-1 and HO-2 to cytoprotection[J].Am J Physiol Heart Circ physiol,2006,290(5):1399-1410.