羅紅春，張紅賓，秦 波，汪嘉莉，劉 倩

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院：1.感染科；2.血液科 400016；3.重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科 401120)

骨髓移植是治療血液病、實(shí)體瘤、免疫系統(tǒng)疾病、急性放射病等疾病的有效方法之一，但移植后的造血重建問題一直是臨床工作的難點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)/CXCR4生物軸對造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells，HSCs)的歸巢和植入起到了重要的作用。另外，RUNX1基因作為一種造血細(xì)胞分化早期的關(guān)鍵調(diào)控因子，對HSCs自我更新與分化間的平衡起著調(diào)節(jié)作用[1-2]。目前，本課題組已經(jīng)成功構(gòu)建pAD-SDF-1-(GlySer)3-RUNX1-IRES-GFP腺病毒載體。在本實(shí)驗(yàn)中，作者將轉(zhuǎn)染pAD-SDF-1-(GlySer)3-RUNX1-IRES-GFP腺病毒載體入間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，并檢測SDF-1/RUNX1融合蛋白介導(dǎo)的MSCs對HSCs增殖和趨化能力的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人臍帶標(biāo)本和臍帶血標(biāo)本，由本院婦產(chǎn)科志愿者產(chǎn)婦提供(均系采自健康男性新生兒胎盤的臍血，其孕母排除病毒性肝炎、艾滋病、梅毒等感染)。

1.2試劑 采用Mesencult培養(yǎng)液(Stem Cell公司)；DMED培養(yǎng)基(上海佳和科技生物有限公司)；Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(天津生物技術(shù)研究所)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；CD29、CD13、CD44、CD34、CD31抗體(BD公司)；RUNX1 ELISA試劑盒(北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司)；SDF-1 ELISA試劑盒(廈門慧嘉生物科技有限公司)。

1.3臍帶源性MSCs的體外培養(yǎng)及生物學(xué)鑒定 標(biāo)本于采集后6 h內(nèi)，進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞的分離：將臍帶剪碎成約1 mm3的小塊后用D-Hanks液沖洗，先后經(jīng)0.1%膠原酶Ⅱ、0.25%胰酶各消化30 min,收集懸浮細(xì)胞，接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的Mesencult′培養(yǎng)液，置于37 ℃、5 % CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，4～5 d后全量換液,棄去非貼壁細(xì)胞,此后每3～4 d半量換液，觀察細(xì)胞至80%融合時(shí)，用0.25%胰酶和1 mmol/L EDTA消化,按1∶3傳代。貼壁細(xì)胞常規(guī)消化后，以CD29、CD13、CD44、CD34、CD31抗體孵育。流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞純度。

1.4人臍血源性CD34+干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及生物學(xué)鑒定 無菌條件下取足月妊娠、正常分娩的新鮮臍血(內(nèi)加抗凝劑)，標(biāo)本于采集后6 h內(nèi)分離。按1∶1體積比加入D-Hanks液稀釋，以Ficoll淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心，1 500 r/min離心15 min。吸取血漿層和分離液層之間的白色云霧狀有核細(xì)胞層，以低糖DMED培養(yǎng)液洗滌備用。應(yīng)用MACS免疫磁珠激活分選系統(tǒng)分離CD34+細(xì)胞，過分選柱2次以提高純度，以流式細(xì)胞術(shù)測定CD34+細(xì)胞純度。

1.5重組腺病毒pAD-SDF-1-(GlySer)3-RUNX1-IRES-GFP對人臍帶源性MSCs轉(zhuǎn)染效率的測定 分別用感染指數(shù)(moi)為25、50、100、200的重組腺病毒感染NIH3T3細(xì)胞。NIH3T3細(xì)胞接種于24孔板，密度為2×106個(gè)/毫升，以DMED培養(yǎng)液作為陰性對照。1 h后吸棄病毒液，加入培養(yǎng)液。此后每12 h在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞GFP的表達(dá)情況。為后續(xù)試驗(yàn)選擇最佳的moi。MSCs培養(yǎng)至第3代時(shí)，調(diào)整密度為2×105個(gè)/毫升，加入24孔板中，培養(yǎng)24 h后，選擇最佳moi的重組腺病毒感染入MSCs。熒光顯微鏡下觀察感染后1、3、7、14 d的感染效率。ELISA方法檢測重組腺病毒pAD-SDF-1-(GlySer)3-RUNX1-IRES-GFP感染MSCs后 SDF-1和RUNX1的表達(dá)。

1.6檢測含重組腺病毒pAD-SDF-1-(GlySer)3-RUNX1-IRES-GFP的人臍帶源性MSCs對人臍血源性CD34+干細(xì)胞的擴(kuò)增作用 調(diào)整CD34+干細(xì)胞的密度為2×104個(gè)/毫升。制備MSCs細(xì)胞滋養(yǎng)層；CD34+細(xì)胞種植于有滋養(yǎng)層的 24孔板中培養(yǎng)，隔日半量換液1次。按照實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆?組，A1組：CD34+干細(xì)胞；B1組：CD34+干細(xì)胞和MSCs；C1組：CD34+干細(xì)胞和基因修飾后的MSCs。每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)第1、3、7、14天檢測CD34+干細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1人臍帶源性MSCs的培養(yǎng)及鑒定 人臍帶源性MSCs長勢良好，呈輻射狀或渦旋狀排列。流式細(xì)胞儀檢測培養(yǎng)第3代的MSCs的表面標(biāo)記物CD29的陽性率為99.83%，CD13的陽性率為98.12%，CD44的陽性率為98.89%；不表達(dá)CD34、CD31。

2.2人臍血源性CD34+干細(xì)胞的純化及鑒定 經(jīng)2次過分選柱，每個(gè)標(biāo)本收集CD34+細(xì)胞數(shù)范圍為(2.6～5)×106，0.4%臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞率均大于96%。流式細(xì)胞儀檢測2次分選后CD34+細(xì)胞純度在98.30%以上。

2.3重組腺病毒pAD-SDF-1-(GlySer)3-RUNX1-IRES-GFP感染人臍帶源性MSCs的效率 當(dāng)重組腺病毒感染的moi為50 pfu/細(xì)胞時(shí)，轉(zhuǎn)染效率最高，可達(dá)90%以上。以moi為50 pfu/細(xì)胞的重組腺病毒感染MSCs后1、3、7、14 d的轉(zhuǎn)染效率分別為(28.42±8.15)%、(80.58±9.05)%、(68.77±6.27)%、(21.34±7.29)%，見封2圖1。ELISA方法檢測出重組腺病毒感染MSCs后3 d SDF-1和RUNX1的表達(dá)最高。感染后7 d，SDF-1和RUNX1的表達(dá)仍然較高(表1)。感染后14 d時(shí)，還有少量SDF-1和RUNX1表達(dá)。

表1 重組腺病毒感染人臍帶源性MSCs后SDF-1和RUNX1的表達(dá)

2.4感染重組腺病毒的人臍帶源性MSCs對人臍血源性CD34+干細(xì)胞的擴(kuò)增作用 按照1.6中的分組，培養(yǎng)第1天，3組中CD34+干細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。培養(yǎng)第3、7、14天，B1組、C1組較A1組CD34+干細(xì)胞顯著擴(kuò)增(P<0.05)。培養(yǎng)第7、14天，B1組中CD34+干細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)顯著高于C1組(P<0.05)，見表2。

表2 感染重組腺病毒的人臍帶源性MSCs對人臍血源性CD34+干細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)

2.5感染重組腺病毒的人臍帶源性MSCs對人臍血源性CD34+干細(xì)胞的趨化作用 按照1.7中的分組，共培養(yǎng)24 h后，Transwell檢測CD34+干細(xì)胞的遷移指數(shù)分別是：A2組(302±8)，B2組(435±20)，C2組(612±18)。B2和C2組的遷移指數(shù)明顯高于A2組(P<0.05)，并且C2組的遷移指數(shù)明顯高于B2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

干細(xì)胞移植后的造血重建過程是一個(gè)多階段、多因素的過程，其中造血微環(huán)境(Niche)的修復(fù)，影響著歸巢造血干細(xì)胞HSCs的自我更新、增殖和分化，對于機(jī)體重建造血功能具有重要意義[3-6]。但移植后HSCs歸巢率低且自我增殖能力有限，成為制約骨髓重建的瓶頸問題。

MSCs作為造血微環(huán)境主要細(xì)胞成分的前體細(xì)胞，在造血調(diào)控中發(fā)揮重要作用。MSCs分化產(chǎn)生的多種骨髓基質(zhì)細(xì)胞，表達(dá)多種基質(zhì)分子，通過細(xì)胞-細(xì)胞間接觸和分泌多種促造血細(xì)胞因子支持造血，MSCs還誘導(dǎo)歸巢受體、分泌基質(zhì)細(xì)胞衍生因子促使HSCs歸巢到骨髓[7-8]，對HSCs保持干細(xì)胞特性和造血干細(xì)胞歸巢具有重要的支持和趨化作用[9-10]。有報(bào)道MSCs與HSCs聯(lián)合移植可促進(jìn)HSCs的植活率，縮短無髓期，減少死亡率。因此，有必要在移植中充分考慮MSCs的因素[11-12]。

研究發(fā)現(xiàn)SDF-1/CXCR4生物軸對HSCs的歸巢和植入起到了重要的調(diào)節(jié)作用[12]。內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞和其他基質(zhì)細(xì)胞均表達(dá)SDF-1，而HSCs表達(dá)CXCR4。內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的SDF-1通過E-和P-選擇素介導(dǎo)HSCs的跨內(nèi)皮遷移。作者在前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)刺激因子較多，可導(dǎo)致HSCs過度分化，使HSCs自我更新能力下降。所以，應(yīng)更多地關(guān)注干細(xì)胞干性的保持問題。RUNX1基因作為一種造血細(xì)胞分化早期的關(guān)鍵調(diào)控因子，即為一個(gè)較佳的選擇。

作者成功分離培養(yǎng)出人臍帶源性MSCs和人臍血源性CD34+干細(xì)胞，且具有較高的純度。利用前期構(gòu)建的pAD-SDF-1-(GlySer)3-RUNX1-IRES-GFP腺病毒轉(zhuǎn)染入臍帶源性MSCs，經(jīng)檢測轉(zhuǎn)染后第3天，轉(zhuǎn)染效率可高達(dá)(80.58±9.05)%。第7天時(shí)，轉(zhuǎn)染效率仍可達(dá)(68.77±6.27)%，雖有所下降，二者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。同樣，作者用ELISA檢測出重組腺病毒感染人臍帶源性MSCs后SDF-1和RUNX1的表達(dá)也是第3天最高，第7天時(shí)仍有較高表達(dá)。

在CD34+干細(xì)胞的擴(kuò)增試驗(yàn)中，感染了重組腺病毒pAD-SDF-1-(GlySer)3-RUNX1-IRES-GFP的MSCs可促進(jìn)CD34+干細(xì)胞的增殖，但其擴(kuò)增程度遠(yuǎn)不及未感染重組腺病毒的MSCs。由此說明，該重組腺病毒既有利于擴(kuò)增CD34+干細(xì)胞，且又不至于讓CD34+干細(xì)胞過度的增殖分化。在Transwell趨化試驗(yàn)中，感染了重組腺病毒的MSCs和未感染重組腺病毒的MSCs均可顯著促進(jìn)CD34+干細(xì)胞的遷移，且前者的趨化作用高于后者(P<0.05)。由此說明，該重組腺病毒轉(zhuǎn)染MSCs后，有明顯的誘導(dǎo)CD34+干細(xì)胞歸巢的作用。

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