楊 林，黨紅星，劉 聰，方 芳，許 峰

(兒童發(fā)育疾病研究省部共建教育部重點實驗室，兒科學重慶市重點實驗室，重慶市“兒童發(fā)育重大疾病診治與預防”國際科技合作基地，重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院PICU，重慶 400014)

氧療是臨床上治療呼吸系統(tǒng)疾病的常用方法，但長時間吸入高濃度氧，可產(chǎn)生大量的氧自由基，從而引起炎癥、細胞損傷、壞死和凋亡，可導致各種急性或慢性肺損傷[1-2]。肺泡上皮細胞是高氧所致肺損傷的主要靶點，其損傷后的修復主要依賴于肺泡Ⅱ型上皮細胞(AECⅡ)的增殖、分化為肺泡Ⅰ型上皮細胞(AECⅠ)。AECⅡ細胞的功能狀態(tài)是決定肺損傷病理轉歸的主要因素[3]。

神經(jīng)肽P物質(SP)廣泛分布于氣道上皮細胞層內，可啟動早期的神經(jīng)源性炎癥反應，參與對損傷細胞的修復、增殖、遷移、分化調控[4-5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)SP能夠降低高氧誘導的氧化損傷，但調節(jié)的分子機制尚不完全清楚[6]。SHH信號通路是一種重要的信號轉導通路，在細胞損傷修復中有著重要的作用，其成員包括SHH、Patched1(Ptch1)、Smoothened(Smo)以及Gli，而Gli1是SHH信號通路最主要的效應分子[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)SHH信號通路在肺的形態(tài)發(fā)生和器官形成中起著至關重要的作用[9-10]，并參與了胚胎形成、組織修復、創(chuàng)傷愈合[11-13]。

SP能否降低高氧暴露對肺泡Ⅱ型上皮細胞的損傷，促進損傷后的修復，且是否與調控SHH信號通路有關，目前，相關研究甚少。本文探討了高氧暴露及SP干預對AECⅡ細胞存活、凋亡及對SHH信號通路分子Gli1的影響，為高氧肺損傷預防和治療提供理論指導和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級雌、雄性SD大鼠，體質量180～200 g，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供，所有實驗遵守國家關懷和使用實驗動物的指導方針，本實驗通過了重慶市倫理委員會審查。

1.2材料 SP(Abcam公司)，DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone公司)，胰蛋白酶(BBI公司)，AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物)，流式細胞儀(美國BD公司)，Gli1多克隆抗體(Abbiotec公司)，BCA蛋白定量檢測試劑盒(北京百泰克公司)，熒光定量PCR儀FTC2000(加拿大)，RT試劑、熒光定量PCR試劑、sybr green Ⅰ(Shine Gene公司)。

1.3早產(chǎn)鼠AECⅡ的分離及培養(yǎng) 健康成年SD大鼠，雌雄按1∶1合籠交配，次日晨查見陰栓記為妊娠第1天，將孕鼠于孕第19天(足月為22 d)時行剖宮產(chǎn)取出早產(chǎn)鼠，分別用0.25%胰酶、0.3%膠原酶消化，采用差速離心和差速貼壁方法分離AECⅡ。AECⅡ純化后24 h接近增殖狀態(tài)，活性良好，用于實驗。每天更換培養(yǎng)液并在相差顯微鏡下觀察其形態(tài)和基本生長情況，巴氏染色法、透射電鏡下觀察培養(yǎng)細胞中是否存在板層小體，巴氏染色法檢測細胞純度，臺盼藍染色檢測細胞存活率，細胞純度達95%，存活率達90%。

1.4氧化損傷性細胞模型制備及實驗分組 原代培養(yǎng)早產(chǎn)鼠AECⅡ，AECⅡ貼壁純化后隨機分組的辦法將細胞分為空氣組、高氧組、高氧+SP組?？諝饨M和高氧組分別將AECⅡ置于氧體積分數(shù)為0.21(21%)和0.95(95%)的密閉氧倉中，高氧SP組于暴露前加入SP 1×10-8mol/L，再置于氧體積分數(shù)為0.95(95%)密閉氧倉暴露，各組細胞密閉氧倉均置于5% CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h后收集細胞檢測。

1.5光鏡和電鏡下觀察細胞形態(tài) 原代培養(yǎng)的AECⅡ細胞，分組培養(yǎng)24 h后收集細胞，通過透射電鏡觀察細胞形態(tài)。

1.6MTT細胞存活檢測 AECⅡ細胞存活率通過3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)試劑盒檢測，按說明書進行。

1.7AnnexinV/PI 雙標記法檢測 AECⅡ凋亡 原代培養(yǎng)的AECⅡ細胞，以1×106個/mL濃度接種于6孔板中，按上述分組處理24 h，胰酶消化貼壁細胞，PBS重懸3次，調整細胞濃度約1×106個/mL，加入5 μL AnnexinV-FITC和10 μL PI，20～25 ℃避光孵育15 min，上流式細胞儀，計算出右下象限的早期凋亡細胞所占比率。

1.8熒光定量PCR檢測Gli1的mRNA的含量 采用TRizol一步法提取AECⅡ的總RNA，測吸光度A260/A280值，計算提取的RNA濃度。逆轉錄合成cDNA，PCR引物由Primer premier 5.0自行設計。擴增Gli1基因正義鏈的引物序列：5′-TGT GGC AAC AGG ACG GAA C-3′，反義鏈序列為：5′-CCA GAG TGT CAG CAG AAG AAA AG-3′；GAPDH正義鏈的引物序列：5′-CCC ATC TAT GAG GGT TAC GC-3′，反義鏈序列為：5′-TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3′。熒光定量PCR擴增條件：94 ℃ 4 min，94 ℃ 20 s、60 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s，共35個循環(huán)，72 ℃檢測信號。記錄deta Ct值，通過2-△△CT計算熒光值，并以GAPDH為標準計算相對比值。

1.9Western blot檢測Gli1的蛋白含量 RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法定量蛋白。取30 μg蛋白質上樣，10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉移至PVDF膜，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉后，與Gli1多克隆抗體適度稀釋，4 ℃振搖孵育過夜，再加入稀釋后辣根過氧化物酶標記的二抗，用ECL法檢測，蛋白條帶用Quantity One 4.5.0軟件進行處理分析，蛋白含量用目的條帶校正容積(Adj volume)/GAPDH校正容積(Adj volume)表示。

2 結 果

2.1高氧暴露及SP干預后AECⅡ形態(tài)學的變化 空氣組：AECⅡ細胞胞漿豐富，含有大小不一的板層小體，胞膜上有微絨毛結構(封3圖1A)。與空氣組比較，高氧暴露24 h，AECⅡ細胞核較空氣組伸展，細胞器減少，線粒體腫脹，板層小體結構變化甚至消失，胞質邊緣有較多吞飲小泡，可見較多早期凋亡的改變(封3圖1B)。SP干預后，與高氧組比較，細胞器變化減輕，細胞形態(tài)基本正常(封3圖1C)。

2.2高氧暴露及SP干預對AECⅡ存活率和凋亡率的影響 與空氣組比較，高氧組AECⅡ在高氧暴露24 h后細胞存活率明顯降低，凋亡率明顯升高(P<0.05)。而在高氧+SP組，SP干預后與單純高氧組比較，AECⅡ存活率明顯增加，凋亡率降低(P<0.05)，見圖2、3。

*：P<0.05，與空氣組比較；#：P<0.05，與高氧組比較。

*：P<0.05，與空氣組比較；#：P<0.05，與高氧組比較。

2.3高氧及SP干預后Gli1 mRNA表達的影響 空氣組AECⅡ，通過熒光定量PCR法可檢測到Gli1 mRNA表達。與空氣組比較，高氧暴露24 h后，AECⅡ內Gli1 mRNA表達升高(P<0.05)。SP干預后，進一步促進高氧組AECⅡ內Gli1 mRNA表達，高氧+SP組Gli1 mRNA水平較單純高氧組升高(P<0.05)，見圖4。

2.4高氧及SP干預對Gli1蛋白表達的影響 空氣組AECⅡ，通過Western blot可檢測到Gli1蛋白表達。與空氣組比較，高氧暴露后，Gli1蛋白表達升高(P<0.05)。SP干預后，進一步促進高氧組AECⅡ內Gli1蛋白表達，高氧+SP組Gli1蛋白表達水平較單純高氧組明顯升高(P<0.05)，見圖5。

*：P<0.05，與空氣組比較；#：P<0.05，與高氧組比較。

*：P<0.05，與空氣組比較；#：P<0.05，與高氧組比較。

3 討 論

慢性肺疾病(CLD)或支氣管肺發(fā)育不良(BPD)是新生兒持續(xù)用氧治療后的一種肺氧化性損傷疾病，在存活的早產(chǎn)兒中可達60%以上，發(fā)生CLD或BPD的早產(chǎn)兒均伴有肺發(fā)育障礙和呼吸功能低下。目前，國際上尚無確定有效的防治方法，但大量臨床資料顯示其病因與肺的發(fā)育成熟及肺損傷修復密切相關[14]。

AECⅡ是肺泡表面一類重要的細胞群體，在肺泡上皮損傷時可不斷增殖，補充和分化為AECⅠ，被稱為肺泡上皮“干細胞”[15]。由于肺損傷的修復完全依賴AECⅡ的增殖和分化，因此尋找保護AECⅡ氧化損傷的因素，可為高氧肺損傷的防治提供理論基礎。

SP是一種重要的感覺神經(jīng)肽，SP釋放后可以特異性地與神經(jīng)激肽1受體(NK1R)結合，具有多種生物學效應，可調節(jié)氣道血流，氣道平滑肌收舒反應，氣道炎癥和上皮細胞損傷后的遷移和增殖[16-17]。急性燒傷患者，SP在增生的疤痕組織中的濃度明顯高于燒傷皮膚，其可能啟動愈合早期的神經(jīng)源性炎癥反應，與細胞增殖、再生和瘢痕形成等密切相關[4]。Oslund等[18]報道通過活化NK1R有助于肺損傷后上皮細胞增殖，是參與損傷修復的重要組件。Yaraee等[19]發(fā)現(xiàn)SP能夠直接調節(jié)人支氣管上皮細胞釋放TGF-β，參與調節(jié)肺損傷修復以及肺纖維化過程。Marwan等[20-21]發(fā)現(xiàn)感覺神經(jīng)遞質通過激活NK1R能夠保護急性高氧肺損傷。Huang等[6]發(fā)現(xiàn)SP對高氧肺損傷有明顯的保護作用，可降低細胞凋亡，促進細胞存活。

本研究發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)鼠AECⅡ高氧暴露24 h，電鏡下可見明顯的細胞損傷和凋亡，流式細胞儀檢測細胞的凋亡率明顯升高，細胞存活明顯降低。SP干預后從細胞的超微結構可見損傷明顯減輕，細胞凋亡率明顯降低，細胞存活率升高。提示SP可以減輕AECⅡ的氧化損傷，維持細胞的正常生理功能，對氧化應激狀態(tài)下的AECⅡ細胞可能起到保護作用。

在大量發(fā)育和腫瘤形成的研究成果中發(fā)現(xiàn)，SHH信號通路對細胞增生起調節(jié)作用，提示該信號途徑也可能參與組織損傷修復和再生過程。Kusano等[11]報道體外心肌細胞給予SHH蛋白能夠保護過氧化氫誘導的細胞凋亡。Lavine報道阻斷正常成年小鼠在體心肌細胞中的SHH信號傳導通路可以導致室腔增大，心肌纖維化，心功能降低甚至死亡。此外，文獻報道SHH信號在骨折、膽道、肝臟損傷的修復中發(fā)揮作用[22-24]。然而，這一信號途徑在呼吸系統(tǒng)，特別是對肺修復再生及AECⅡ細胞損傷修復中的作用還不十分明確。Bellusci等[25]報道SHH信號通路在肺的支氣管形態(tài)發(fā)育中具有重要作用，轉基因老鼠過表達SHH可促進間葉細胞和上皮細胞的增殖。SHH信號通路中的核轉錄因子Gli1有3種，即Gli1、Gli2、Gli3，Gli1是SHH信號途徑最重要的下游轉錄因子之一，也是SHH信號最終的響應者和功能的執(zhí)行者[26]。Grindley等[27]發(fā)現(xiàn)在肺組織SHH基因過表達時，Gli1 mRNA明顯上調，參與肺發(fā)育的調控。因而，Gli1的表達反映了SHH信號通路的功能狀態(tài)。

本研究顯示，SHH信號通路參與了高氧誘導細胞凋亡的信號轉導系統(tǒng)，高氧暴露后Gli1信號分子表達明顯增加，可能參與高氧損傷后早期的防御作用。SP干預后，進一步激活高氧組AECⅡ內Gli1信號分子基因和蛋白表達，同時，AECⅡ凋亡率降低，存活率增加，顯示對高氧暴露下AECⅡ起到一定的保護作用。提示SP可抑制細胞的凋亡，促進細胞存活，其可能通過對SHH信號途徑激活而對氧化應激狀態(tài)下的AECⅡ起到保護作用。

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