陶錚 滕晉

近年來國(guó)內(nèi)外對(duì)斑馬魚的研究逐漸深入,由于斑馬魚早期發(fā)育的過程中胚胎透明,可直接觀察到各組織器官,并且血管系統(tǒng)生成方式簡(jiǎn)單,在顯微鏡下就能夠直觀的觀察到節(jié)間血管形態(tài),因而以之作為理想的研究血管形成藥物篩選模式動(dòng)物[1]。血管熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚可以于熒光顯微鏡下清晰地進(jìn)行斑馬魚節(jié)間血管的計(jì)數(shù),考察藥物的抑制血管生成的作用,能夠快捷的計(jì)算抑制率。本試驗(yàn)觀察芪燈明目膠囊對(duì)斑馬魚血管生成的影響,并且通過實(shí)驗(yàn)得出斑馬魚的最大耐受濃度,對(duì)藥品毒理實(shí)驗(yàn)提供參考指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

(1)VEGF轉(zhuǎn)基因斑馬魚由山東省科學(xué)院藥物篩選平臺(tái)提供,芪燈明目膠囊由成都中醫(yī)藥大學(xué)眼科實(shí)驗(yàn)室提供。

(2)實(shí)驗(yàn)儀器儀器:Airtech 潔凈工作臺(tái),日本 OLMPUS SZX-16熒光顯微鏡,日本 OLMPUS X1倒置顯微鏡,培養(yǎng)皿,24孔板,滅菌手術(shù)器械(手術(shù)刀,剪刀,鑷子,注射器等),乙醚,酒精等。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

(1)斑馬魚準(zhǔn)備:實(shí)驗(yàn)所用的斑馬魚為血管熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚(VEGFR2:GFP)。斑馬魚的養(yǎng)殖和培育參照Westerfield[2]的方法。選擇成熟斑馬魚雌雄一對(duì),傍晚時(shí)放入培育缸中,產(chǎn)卵后取出受精卵,單獨(dú)放入28℃光照培養(yǎng)箱備用。

(2)施藥:魚胚胎于24hpf后取出,置于1 μg·ml-1鏈霉蛋白酶溶液中數(shù)分鐘后,用吸管吹去胚胎卵膜,將脫膜胚胎加入24孔板中,每孔20只;將試驗(yàn)藥物加入24孔板中,分別設(shè)置對(duì)照組,對(duì)照組10個(gè),不加入任何藥物;芪燈膠囊組分別配制終濃度為165 μg·ml-1、248 μg·ml-1、330 μg·ml-1、495 μg·ml-1、660 μg·ml-1、825 μg·ml-1等6個(gè)組,24小時(shí)后觀察結(jié)果。

(3)結(jié)果觀察:將試驗(yàn)用24孔板取出,每孔取出 30 μl溶液,加入 1‰三卡因溶液麻醉魚體,隨后用吸管吸出魚體放于載玻片上,在熒光顯微鏡下觀察記錄斑馬魚異常和血管熒光強(qiáng)弱狀況,并對(duì)體節(jié)間血管計(jì)數(shù),同時(shí)記錄死亡數(shù)。

1.3血管抑制率的計(jì)算

多個(gè)樣本均數(shù)采用單因素方差分析,組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1斑馬魚節(jié)間血管抑制率實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示芪燈明目膠囊具有抑制血管生成的作用,在248 μg·ml-1至660 μg·ml-1抑制率表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,即使在濃度165 μg·ml-1時(shí)仍然具有部分抑制節(jié)間血管形成的作用,表現(xiàn)出芪燈明目膠囊能明顯抑制斑馬魚模型體節(jié)間血管生成。

表1 芪燈明目膠囊對(duì)斑馬魚胚胎體節(jié)間血管生成的抑制作用

注：與對(duì)照組相比較,*P<0.05,**P<010

圖

2.2斑馬魚最大耐受濃度實(shí)驗(yàn)

結(jié)果顯示,用藥組胚胎165 μg·ml-1～495 μg·ml-1均能良好生長(zhǎng),660 μg·ml-1濃度以上各組胚胎出現(xiàn)了心率緩慢和翹尾的體態(tài)變化,濃度達(dá)到825 μg·ml-1大部分胚胎死亡,僅有少部分存活。

通過該實(shí)驗(yàn)我們可以看到,芪燈明目膠囊對(duì)于斑馬魚最大耐受濃度達(dá)到660 μg·ml-1,通過其與大鼠劑量轉(zhuǎn)換關(guān)系,再結(jié)合《人和動(dòng)物的體表面積計(jì)算法、不同種類動(dòng)物之間藥物劑量換算法》[2]推論出芪燈明目膠囊人最大耐受劑量為105.6 mg/kg。

3 討論

斑馬魚是近年來新興的抗血管生成藥物篩選模型,具有易于觀察、實(shí)驗(yàn)周期短、樣品用量少等優(yōu)點(diǎn),與分子、細(xì)胞水平篩選模型相比較有自身的優(yōu)勢(shì)。國(guó)外學(xué)者研究認(rèn)為斑馬魚胚胎特別是血管熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎是一種較理想的抗血管生成活性評(píng)價(jià)活體動(dòng)物模型[3]。本試驗(yàn)應(yīng)用此模型研究了芪燈明目膠囊的抑制血管生成作用,結(jié)果顯示其能夠抑制斑馬魚胚胎體節(jié)間血管生成。本實(shí)驗(yàn)中所用轉(zhuǎn)基因斑馬魚是將熒光蛋白標(biāo)記在血管 VEGFR2上,血管在紫外光激發(fā)下顯現(xiàn)出熒光血管的形態(tài),可在顯微鏡下直接觀察計(jì)數(shù),觀察血管的形成非常簡(jiǎn)易方便。

芪燈明目膠囊是針對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變非增殖期的陰虛燥熱,肝腎虧虛和目絡(luò)癖滯的基本病機(jī),以益氣養(yǎng)陰,活血通絡(luò)之法,結(jié)合臨床及中藥的現(xiàn)代研究的成果,優(yōu)選三味中藥并對(duì)其進(jìn)行了現(xiàn)代工藝的提取,確定以黃酮類物質(zhì)為主的有效部位群制而成。DR的發(fā)生發(fā)展與VEGF、FGF、EGF等多種新生血管生長(zhǎng)因子有關(guān),VEGF是一種直接反映視網(wǎng)膜新生血管進(jìn)程的重要的分子信號(hào),在視網(wǎng)膜病變的早期發(fā)展中起重要的作用[4]。此次研究,過觀察藥物對(duì)轉(zhuǎn)基因熒光標(biāo)記VEGFR2的斑馬魚血管生成的影響,證明了芪燈明目膠囊對(duì)VEGF2的抑制作用,能夠?qū)μ悄虿∫暰W(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展起到一定的預(yù)防和治療作用,也為接下來的機(jī)制研究提供證據(jù)支持。

[1] Westerfield M,Wegner J,Jegalian BG,Specific activation of mammalian Hox promoters in mosaic transgenic zebrafish[J].Genes Dev,1992 Apr;6(4):591-8.

[2] 章元沛.藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].2.人民衛(wèi)生出版社:238.

[3] Cross LM,Cook M A,Lin S,et al.Rapid analys is of angio-genesis drugs in a live fluorescent zebrafish assay [J].Arterio-scler Thromb Vasc Biol,2003,23(5):911-912.

[4] 李強(qiáng),段俊國(guó),王紅義.芪燈明目膠囊對(duì)自發(fā)性糖尿病大鼠視網(wǎng)膜蛋白激酶C表達(dá)的影響[J].眼科新進(jìn)展,2010,3(3):210-213.