吳要華 葉河江 張曉婷 王文麗 盧艷平 嚴然 鐘振東

增生性玻璃體視網膜病變(Proliferative vitreoretinopathy,PVR)是臨床常見致盲眼病,其發(fā)病機制較為復雜,但大家公認PVR的發(fā)病機制主要是一個細胞介導的病理過程[1]。其基本病理過程主要表現(xiàn)為細胞的增生及增生膜的形成與收縮。其中細胞包括RPE、神經膠質細胞、巨噬細胞、成纖維細胞等,以前的研究多集中在視網膜色素上皮細胞(Retinal pigment epithelial cells,RPE)細胞,而對另一關鍵細胞müller細胞研究較少涉及。müller細胞是視網膜中的主要神經膠質細胞[2],在視網膜的整個功能活動和病理生理中起著重要作用[3]。有文獻[4]提到視網膜損傷后早期müller細胞即出現(xiàn)反應性膠質化。但müller細胞發(fā)生反應性改變的分子機制及信號傳導以及對視網膜功能影響的機制并不清楚。而膠質纖維酸性蛋白(GFAP)是müller細胞的主要構成部分。故我們研究兔眼發(fā)生增生性玻璃體視網膜病變后müller細胞GFAP表達的變化,以探討GFAP免疫反應變化在müller細胞反性應膠質化中的作用,為進一步研究müller細胞在PVR中的作用及機制打下基礎。

1 材料與方法

1.1材料

實驗動物:青紫藍兔54只,體重1.5～3.0kg不等,雌雄不限(裂隙燈及檢眼鏡檢查以排除外眼及眼底疾病),許可證:SCXK(川)2008-14,由四川省實驗動物專業(yè)委員會養(yǎng)殖場提供?；錾⒔Y片:由水蛭、三棱、山楂、昆布、海藻等中草藥按現(xiàn)代制劑制備工藝制成,西安碑林藥業(yè)股份有限公司生產,臨用時用三蒸水按照所需濃度進行稀釋。使用時研成粉末,三蒸水混合,配制成混懸液。道諾霉素,意大利生產,購自SIGMA公司,批號:010M1117V。臨用前無菌生理鹽水配制成0.05mg/ml溶液。GFAP一抗、S- P免疫組化染色超敏試劑盒、DAB顯色試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.2方法

1.2.1動物分組造模、給藥及標本采集:54只成年健康青紫藍兔隨機分成6組,分別為正常組、陰性對照組、陽性對照組和化瘀散結片高、中、低劑量組,每組9只兔18只眼。除正常組外,其余5組兔參照朱丹[5]等的方法造成增生性玻璃體視網膜病變動物模型。造模前用氯霉素滴眼液滴雙眼,3次/日共3天。術前用美多麗眼液散瞳直徑約8mm,鹽酸丙美卡因滴眼液角膜表面麻醉,3%戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射(1ml/kg)全身麻醉。將家兔的四肢固定,頭部置于顯微鏡手術臺上。充分暴露眼球。用一空針抽取事先備用的Dispase I液0.05ml于6點鐘角膜緣后3～4 mm處穿透鞏膜,進入玻璃體腔,當瞳孔區(qū)見到針尖抵達玻璃體中央時,將針尖斜面向上,緩慢注入,拔針后立即用棉簽壓迫針孔lmin左右以防止反流。術后雙眼滴氯霉素滴眼液,3次/日共7天。共造模45只兔子?？瞻讓φ战M9只兔子則向玻璃體腔注0.05ml無菌生理鹽水,操作方法同上。造模后在有增殖條帶出現(xiàn)時開始給藥,正常對照組、模型對照組玻璃體腔注射無菌生理鹽水0.1ml共一次,三蒸水(5ml/kg)連續(xù)灌胃28天,1次/日;陽性對照組玻璃體腔注射道諾霉素溶液(0.05g/ml)0.1ml共一次,三蒸水(5ml/kg)連續(xù)灌胃28天,1次/日;化瘀散結片高、中、低劑量組分別按1g /5ml /kg、0.5g /5ml /kg、0.25g /5ml /kg的濃度連續(xù)灌胃28天,1次/日。給藥28天后處死動物,立即摘除眼球,各組隨機選取9只眼球,4%多聚甲醛固定一周后取出眼球。

1.2.2觀察指標與方法:石蠟切片經常規(guī)二甲苯脫蠟,梯度乙醇脫水后,采用S- P免疫組化法檢測視網膜組織GFAP的表達。DAB顯色,蘇木素復染,脫水,透明、封片。陰性對照省去滴加GFAP一抗的步驟。用圖像分析軟件Motic Images Advanced計算IOD值(積分光密度),測量GFAP表達水平。

1.3統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1增生性玻璃體視網膜病變后GFAP的表達免疫組化染色及OD值

正常對照組:兔眼視網膜內界膜下可見少許狀棕色陽性GFAP著色,其余視網膜各層未見陽性GFAP著色(圖1)。

模型對照組:在內界膜、外界膜和色素上皮層均充滿了棕色陽性GFAP著色。視網膜全層結構模糊不整齊,各層細胞排列紊亂,細胞形態(tài)不清。

陽性對照組:在內界膜、視網膜神經纖維層、視網膜神經節(jié)細胞層、內從狀層、內核層、外叢狀層可見稀疏的垂直于視網膜長軸分布的線條狀GFAP陽性著色,未延伸到外核層。視網膜全層結構清晰整齊,各層細胞排列整齊,細胞形態(tài)清晰。

高劑量治療組:在內界膜、視網膜神經纖維層、視網膜神經節(jié)細胞層、內從狀層、內核層可見稀疏的垂直于視網膜長軸分布的線條狀GFAP陽性著色,未延伸到外叢狀層。視網膜全層結構清晰整齊,各層細胞排列整齊,細胞形態(tài)清晰。

中劑量治療組:在內界膜、視網膜神經纖維層、視網膜神經節(jié)細胞層、內從狀層、內核層、外叢狀層、外核層可見稀疏的垂直于視網膜長軸分布的線條狀GFAP陽性著色,未延伸到外叢狀層。視網膜全層結構清晰整齊,各層細胞排列整齊,細胞形態(tài)清晰。

低劑量治療組:在視網膜各層可見垂直于視網膜長軸分布的線條狀GFAP陽性著色,視網膜全層結構不甚清晰整齊,各層細胞排列不整齊,細胞形態(tài)不清。

圖1 (黑色箭頭表示棕褐色染色×200)

表1 各組GFAPIOD值的變化

注：與空白對照組比較:“△”P<0.05;“△△”P<0.01

與陰性對照組比較:“▲”P<0.05;“▲▲”P<0.01

“★”:陽性對組有一只動物的左眼并發(fā)眼內炎癥,故未列入觀察

“■”:中劑量治療組一只動物在麻醉過程中死亡,一只動物的左眼并發(fā)眼內炎癥

3 討論

PVR是引起孔源性視網膜脫離手術失敗和復發(fā)的最重要原因,在手術成功的病例中也可因PVR的存在影響患者視功能[6]。臨床上孔源性視網膜脫離中PVR發(fā)生率約為5%～10%[7,8]。

Müller細胞是PVR增生膜中的重要成分[9],在PVR發(fā)發(fā)展過程中起著重要作用。有研究[10]提示與以往認識相比,müller細胞可能在PVR增生膜中發(fā)揮更加積極的作用,特別是在RPE細胞豐富的環(huán)境中刺激下。GFAP是構成膠質細胞支架的主要部分,由于其不與神經元及其突起、肌細胞、肌原纖維、成纖維細胞等發(fā)生免疫反應而有別于波形蛋白(vimentin)和結蛋白(desmin),常被作為膠質細胞的特征性標記物應用于免疫研究[11]。GFAP的表達增加水平,反映了Müller細胞分化增生的活躍程度。

中醫(yī)學目前認為增生性玻璃體視網膜病變屬于眼科血證中死血、干血的范疇,是眼科血證的晚期病癥,其具體表現(xiàn)為在神膏內或視衣上形成有形之物,牽拉視衣,致視衣脫離。死血與干血分別出現(xiàn)于眼科血證的不同時期。臨床上死血期多見于眼內出血后約45天到75天;而干血期則發(fā)生于出血后75天以上。其病機多為脾虛、腎虛或濕熱等,導致陽氣陰血不能充養(yǎng)于目,一方面視衣失于滋養(yǎng)或固攝;另一方面目失所養(yǎng)使病理產物蓄積(氣滯、瘀血、水積、痰飲等)而成本病,故應以活血化瘀、軟堅散結為其治療大法。而化瘀散結片具活血化瘀、消積導滯、軟堅散結之功。既往研究表明:化瘀散結片能提高源于雙極細胞或müller細胞的b波波幅,縮短b波峰潛時,從而改善視網膜功能[12];同時化瘀散結片能抑制誘導神經膠質細胞增殖的血管細胞粘附分子(VCAM-1)的表達[13,14],進而抑制PVR的發(fā)展。本實驗采用免疫組化半定量方法,發(fā)現(xiàn)模型對照組GFAP的IOD高于空白對照組,有極顯著差異(P<0.01),提示造模成功;模型對照組GFAP的IOD值高于陽性對照組,有極顯著差異(P<0.01);模型對照組GFAP的IOD值高于化瘀散結片高劑量治療組、中劑量治療組,有極顯著差異(P<0.01),與低劑量治療組比較無差異(P>0.05)表明化瘀散結片能減少GFAP表達水平,可抑制müller細胞增殖,減輕對視網膜的過度損傷反應,從而抑制PVR的進一步發(fā)展。

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