陶錚 段俊國 高娜 李強

通過前期芪燈明目膠囊對VEGF轉(zhuǎn)基因斑馬魚血管生成的影響研究,發(fā)現(xiàn)膠囊有效成分之一葛根素具有抑制血管生成的作用,我們利用人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)增殖模型和雞胚絨毛尿囊膜(CAM)模型進一步試驗,證實了葛根素具有抗血管生成活性。

1 材料與方法

1.1實驗材料

臍內(nèi)皮細胞(HUVEC)由齊魯制藥公司藥物研究院提供,第7代;雞胚由濟南滋平種蛋有限公司提供。

試劑:M199培養(yǎng)基及DMEM購自Gibco公司(Life Technologies,Grand Island,NY,USA);二苯基四氮唑溴鹽(MTT)購自上海生物工程有限公司,胎牛血清購自Gibco公司;Matrigel 購自BD公司;其它試劑為國產(chǎn)分析純,生理鹽水。

實驗儀器儀器:Airtech 潔凈工作臺,德國Binder CO2培養(yǎng)箱,美國DYNEX Spectra MR 1SPA-0093型酶標儀,日本 OLMPUS X1倒置顯微鏡,培養(yǎng)皿,96孔板,滅菌手術(shù)器械(手術(shù)刀,剪刀,鑷子,注射器等),乙醚,酒精等。

1.2實驗方法

(1)觀察多個濃度下葛根素對臍內(nèi)皮細胞增殖的抑制作用。

實驗步驟:HUVEC用無血清的M199培養(yǎng)液稀釋到1×105個/mL,按96孔板每孔100μl接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔加2%成纖維細胞生長因子(bGFG),96孔板放入CO2培養(yǎng)箱24 h。細胞貼壁后去除培養(yǎng)基,實驗組分別加入終濃度為20 μg·mL-1、40 μg·mL-1、80 μg·mL-1的含葛根素的M199培養(yǎng)基,溶劑對照組加入含0.1%DMSO的M199培養(yǎng)基;另設(shè)空白對照組,只加入M199培養(yǎng)基。每組均設(shè)4個復(fù)孔,培養(yǎng)24 h后,各孔加入20 μL/孔MTT溶液(5 g/L)繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清液,加入150 μL DMSO溶解,振蕩混勻。在自動酶標儀上570 nm處檢測吸光度(A)值記錄OD值,統(tǒng)計各組細胞數(shù)量并計算各組抑制率。

抑制率的計算方法如下:

(2)觀察多個濃度下葛根素對雞胚尿囊膜微血管生成的抑制作用

實驗步驟:取7日齡50只雞胚蛋,隨機分組為5組,每組10個,在照卵燈下尋找胚頭中軸側(cè)區(qū)域,劃定1 cm×1 cm圓形開窗部位,用75%乙醇溶液消毒開窗部位,在雞胚氣室端鉆孔2 mm小孔并穿透殼膜。暴露出雞胚尿囊膜,將明膠海綿放置于尿囊膜上血管部位,用微量進樣器將葛根素配液滴加入甲基纖維素濾膜中,分別為60 μg/個、100 μg/個,160 μg/個加藥完畢后用膠帶密實封口。并繼續(xù)放入38℃的孵箱內(nèi)孵育72 h。

新生血管數(shù)量計算:揭開透明膠帶,加滿4%多聚甲醛,4℃下原位固定30 min。待CAM上血管內(nèi)的血液凝固后,揭去封窗的透明膜,剪除CAM水平以上的蛋殼,以濾膜載體為中心把CAM剪下,投入水中,使其舒展開,并將其在水中轉(zhuǎn)移到載玻片上,自然干燥。拍照后用Photoshop選定照片上的一定面積(300×300像素),計算3個面積內(nèi)的平均血管數(shù)目計入統(tǒng)計,并運用Image pro-plus統(tǒng)計血管面積計入統(tǒng)計。

2 實驗結(jié)果

2.1內(nèi)皮細胞的增殖的抑制作用

實驗結(jié)果顯示對照組細胞生長良好,溶劑組對細胞生長無影響;用藥組葛根素從10～80 μg·mL-1均顯示出明顯的抑制內(nèi)皮細胞生長的作用,在20 μg·mL-1就顯示出較佳的抑制率,達到25%抑制率,40 μg·mL-1以上未見劑量依賴性增長。

2.2葛根素對雞胚尿囊膜微血管生成的抑制作用

實驗結(jié)果顯示,對照組微孔濾膜周圍血管CAM血管生成良好,成樹枝狀呈非特異性的貫穿、雜亂、包繞、葉脈樣、平行生長,手術(shù)組微孔濾膜周圍CAM血管數(shù)目明顯多于對照組,用藥組出現(xiàn)用藥區(qū)域無血管區(qū)或血管斷裂現(xiàn)象,且血管變細、側(cè)枝減少、藥物濾膜遠端血管密度增加等現(xiàn)象,尤其細小血管數(shù)目顯著減少。與對照組比較葛根組160 μg·mL-1具有顯著性抑制血管面積的作用,與手術(shù)組比較葛根組中高劑量具有顯著性抑制血管面積的作用。

A:對照組.B:葛根素20 μg·mL-1.C:葛根素40 μg·mL-1.D:葛根素80 μg·mL-1.

注:與對照組比較△P<0.01;與手術(shù)組比較**P<0.01

3 討論

葛根素(puerarin)是由豆科植物野葛(puerarialobata)甘葛藤(puerarinthomsonii)根中提取的一種黃酮昔。具β腎上腺素受體阻滯作用,可增強心肌收縮力,保護心肌細胞;擴張血管,降低血壓及眼內(nèi)壓,改善微循環(huán)的功效。國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)糖尿病伴血管病變患者靜滴葛根素3個療程后,血漿ET水平降低,N0水平升高,而對照組無此現(xiàn)象[1]。表明葛根素有通過改善血流動力學,糾正神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的失衡及對內(nèi)皮細胞的保護作用,從而達到防治糖尿病血管并發(fā)癥的目的,但具體抑制新生血管的機制有待研究。

A:對照組.B:手術(shù)組。C:葛根素60 μg.D:葛根素100 μg.E:葛根素160 μg

葛根素是芪燈明目膠囊有效成分之一,芪燈明目膠囊是針對糖尿病視網(wǎng)膜病變非增殖期的陰虛燥熱,肝腎虧虛和目絡(luò)癖滯的基本病機,以益氣養(yǎng)陰,活血通絡(luò)之法,結(jié)合臨床及中藥的現(xiàn)代研究的成果,優(yōu)選三味中藥并對其進行了現(xiàn)代工藝的提取,確定以黃酮類物質(zhì)為主的有效部位群制而成。DR的發(fā)生發(fā)展與VEGF、FGF、EGF等多種新生血管生長因子有關(guān),VEGF是一種直接反映視網(wǎng)膜新生血管進程的重要的分子信號,在視網(wǎng)膜病變的早期發(fā)展中起重要的作用[2]。此次研究發(fā)現(xiàn)葛根素在10～80 μg·mL-1范圍內(nèi)均具有抑制臍內(nèi)皮細胞增殖的作用,在60～160μg/個范圍內(nèi)均具有較強的抑制雞胚尿囊膜微血管生成的作用?？梢灾儡螣裘髂磕z囊能夠?qū)μ悄虿∫暰W(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展起到一定的預(yù)防和治療作用,為接下來重點針對新生血管生長因子信號傳導(dǎo)通路的機制研究提供證據(jù)引導(dǎo)。

[1] 杜紅艷.葛根素治療缺血性視神經(jīng)病變的療效觀察[J].臨床眼科雜志,2003,11(1):77.

[2] 李強,段俊國,王紅義.芪燈明目膠囊對自發(fā)性糖尿病大鼠視網(wǎng)膜蛋白激酶C表達的影響[J].眼科新進展,2010,3(3):210-213.