呂 中，黃慧芳，趙慧平，洪 岱，楊 浩，陳 嶸

（武漢工程大學 綠色化工過程教育部重點實驗室 湖北省新型反應器與綠色化學工藝重點實驗室，武漢 430073）

白藜蘆醇／β－環(huán)糊精包裹物清除過氧亞硝基作用研究

呂 中，黃慧芳，趙慧平，洪 岱，楊 浩，陳 嶸＊

（武漢工程大學 綠色化工過程教育部重點實驗室 湖北省新型反應器與綠色化學工藝重點實驗室，武漢 430073）

抗腫瘤、抗心血管疾病藥物白藜蘆醇（Resveratrol，Res）由于難溶于水、不穩(wěn)定而限制了其廣泛應用，采用β－環(huán)糊精（β－cyclodextrin，β－CD）包裹可克服上述缺陷.研究結果表明隨著β－CD濃度增大，Res的水溶性明顯增加，Res與β－CD形成包裹物的化學計量比為1∶1.體外實驗證實Res／β－CD包裹物可清除具有強氧化與硝化性的過氧亞硝基ONOO－，低溫有利于清除反應的進行，CO2的存在減少與ONOO－反應的Res／β－CD包裹物量.

白藜蘆醇；β－環(huán)糊精；包裹物；過氧亞硝基

環(huán)糊精（Cyclodextrin，CD）是一種水溶性、非還原性、不易被酸水解的白色晶體，無毒，可食用，由環(huán)糊精糖基轉移酶作用于淀粉而形成的一類環(huán)狀低聚糖.常見的CD是由6～8個葡萄糖單元以1，4－糖苷鍵結合而成的 α－CD、β－CD 以及 γ－CD 3種.CD分子呈錐形的圓環(huán)結構，外壁為親水性，內部的疏水性空腔可以作為受體借助分子間相互作用包裹各種無機及有機分子形成包裹物，以改變這些化合物的物理化學性質及降低它們的不穩(wěn)定性.目前CD包裹物已廣泛應用于制藥、分析化學、環(huán)保、有機合成、食品等諸多領域［1-2］.β－CD與其它天然的CD及化學改性的CD相比，具有空腔大小合適、包裹能力較高、生產成本低、來源廣等優(yōu)點，成為目前應用得最為廣泛的CD產品.

白藜蘆醇（Resveratrol，Res）化學名為3，4’，5－三羥基二苯乙烯，是植物在遇到不利條件下自然產生的抗毒素，在葡萄、虎杖和花生等72種植物中存在，其中新鮮葡萄皮中的含量最高［3］.紅酒中Res的含量可達1.5～3mg／L，是其可降低心血管疾病死亡率的直接原因［4］.隨著對 Res研究的深入，人們發(fā)現它具有多種藥理活性，如調節(jié)脂蛋白代謝，抑制低密度脂蛋白氧化［5］；抑制血小板聚集和減少前列腺素的產生等［6］.Res真正引起人們的廣泛關注是在1997年Jang等在Science上較系統(tǒng)地報道了Res的抗腫瘤作用［7］，對其抗腫瘤作用的研究逐漸成為Res研究的熱點.

Res疏水性強，在水中幾乎不溶解，對空氣、光、氧化劑敏感，且代謝及排泄速度快［8］，嚴重影響了其在臨床上的廣泛使用.用CD包裹Res形成水溶性的包裹物可克服上述缺陷.

到目前為止，有關Res／CD包裹物的研究報道大部分集中在包裹物的表征和包裹過程動力學及熱力學參數的確定［9-12］，有關包裹物的生物活性報道較少.Lucas－Abellán測定了 Res／CD 包裹物對氧自由基的清除活性［13］，Berta報道了含 Res／HPCD的泡沫和漱口水可顯著抑制倉鼠口腔鱗狀細胞癌的增殖［14］，本課題組報道了Res／CD包裹物清除DPPH自由基活性［15］.

過氧亞硝 基陰離子（Peroxynitrite anion，ONOO－）存在于人體內皮細胞、神經細胞、巨噬細胞、嗜中性細胞［16］，其強氧化及硝化特性可引起細胞內DNA、蛋白質及脂等大分子的損傷，使細胞的代謝發(fā)生障礙及能量耗竭，導致細胞凋亡、損傷，甚至死亡.本課題組曾報道Res具有清除ONOO－引起的DNA損傷［17］，及 Res／羥丙基－β－環(huán)糊精（hydroxypropyl－β－CD，HP－CD）包裹物能清除ONOO－［18］.由于β－CD比 HP－CD價廉且易得，因而采用β－CD包裹Res制得包裹物比采用 HP－CD更有優(yōu)勢.本研究采用β－CD包裹 Res，對 Res／β－CD包裹物與ONOO－的反應進行研究，并考查溫度及CO2對反應的影響，以期為Res／β－CD包裹物的應用提供一定的實驗基礎.

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

Res（99%），購自 Sigma公司；β－CD，二乙烯三胺五乙酸（DTPA）購自國藥.

ONOO－合成：由亞硝酸鈉和酸性 H2O2按文獻［19］合成，過量的 H2O2用 MnO2除去（6mg／mL，4℃，30min），過濾除去多余的 MnO2.合成的ONOO－原液在－20℃ 保存，臨用前用4mmol／L NaOH稀釋，濃度由302nm的吸光值計算（ε＝1670L· mol－1·cm－1）.

其它試劑均為國產分析純，實驗用水為超純水.

Perkin Elmer Lambda 35紫外／可見分光光度計（美國）.

1.2 Res與β－CD相互作用的紫外光譜

Res溶于50%二甲基亞砜中配成50mmol／L原液，避光保存在4℃冰箱.將25μmol／L的 Res與不同濃度的β－CD相混合，25℃振蕩4h，在240～400nm范圍測量Res與不同濃度β－CD混合后溶液的紫外光譜.

1.3 相溶解性實驗

［20］，過量固體Res加入不同濃度的β－CD水溶液中，25℃ 下振蕩24h，為防止Res的光化學降解，離心管用錫紙包裹.平衡后樣品用0.45μm濾膜過濾以除去未溶解的Res固體.Res的溶解量用紫外光度計測量.

包裹物的結合常數KC（stability constant）由相溶解度圖按Higuchi－Connors方程計算：

S0為Res在25℃ 時水中的溶解度，斜率為相溶解度圖中相應曲線的斜率.

1.4 Res／β－CD 包裹物與過氧亞硝基作用

Res／6mmol／Lβ－CD 包裹物（6mmol／Lβ－CD包裹Res所形成的包裹物）200mL與ONOO－（濃度分別為0、20、40、60、80、100、120、140 μmol／L） 在 25℃、pH 6.9 緩 沖 溶 液（50mmol／L 磷 酸 鹽、0.1mmol／L DTPA、10mmol／L NaCl）中進行反應，ONOO－的加入不改變反應體系的pH.在實驗條件下ONOO－自分解的半衰期不到2s［21］，因此加入ONOO－的同時須劇烈攪拌溶液.Res／6mmol／Lβ－CD 包裹物在306nm處有最大吸收峰，而 ONOO－在pH 6.9緩沖液中快速分解后，在此無吸收峰.通過測定306nm處的光吸收變化來檢測反應剩余的Res／6mmol／Lβ－CD包裹物.反應5min后用紫外／可見分光光度計記錄光譜變化.

2 結果與討論

2.1 Res與β－CD相互作用的紫外光譜

如圖1所示，β－CD在測量范圍內沒有光吸收，Res在304nm處有最大吸收峰，加入β－CD后其最大吸收峰紅移約2nm，說明Res與β－CD發(fā)生了包裹作用.

圖1 Res與β－CD相互作用的紫外可見光譜Fig.1 UV－vis spectrum of Res withβ－CD interaction

將25μmol／L Res加入不同濃度的β－CD溶液中，測得的最大吸收峰、吸光值及由朗伯－比爾定律計算所得的消光系數ε見表1.

表1 Res與β－CD相互作用的紫外數據Tab.1 The UV－vis data of Res withβ－CD interactions

由表1中數據，取306nm處β－CD存在時的消光系數平均值40.83×103L· mol－1·cm－1確定Res／β－CD包裹物中Res的濃度.

2.2 相溶解性實驗

將溶解的Res濃度對相應的β－CD濃度作圖，結果見圖2.Res濃度隨β－CD濃度增加呈線性增加，說明 Res與β－CD形成的包裹物分子比為1∶1［20］，與 Res／HP－CD包裹物分子比相同；Res與β－CD的結合常數由式（1）計算為1815L·mol－1，小于Res與 HP－CD 結合常數［18］.

圖2 Res在β－CD中的相溶解性圖（25℃）Fig.2 Phase－solubility diagram of Res inβ－CD solution

2.3 Res／β－CD包裹物與過氧亞硝基相互作用

Res／6mmol／Lβ－CD包裹物與ONOO－ 在pH 6.9條件下相互作用的紫外光譜見圖3.ONOO－在pH 6.9緩沖液中快速分解，測量范圍內無吸收峰.隨著加入包裹物中ONOO－濃度不斷增大（0～140μmol／L），溶液的吸收值不斷降低，即包裹物濃度不斷降低.當ONOO－在緩沖液中預先分解，再加入Res溶液中，則Res光譜不發(fā)生變化（數據未顯示）.

圖3 Res／6mmol／Lβ－CD包裹物與 ONOO－作用的紫外可見光譜Fig.3 UV－vis spectrum of Res／6mmol／Lβ－CD with ONOO－reaction

由 Res與 ONOO－ 的反應機理［17］，可推斷Res／β－CD包裹物與ONOO－可能的反應機理：

2.4 溫度對Res／β－CD包裹物與過氧亞硝基相互作用影響

25℃、37℃ 及 50℃ 時 Res／6mmol／Lβ－CD包裹物與ONOO－的反應結果見圖4.

圖4 溫度對 Res／6mmol／Lβ－CD 包裹物與ONOO－反應的影響Fig.4 Effects of temperature on the reaction of Res／6mmol／Lβ－CD with ONOO－

由圖4可知，隨著溫度升高，包裹物的光吸收值不斷增大，即體系中未反應的包裹物增加.當ONOO－濃度為80μmol／L時，溫度從25℃ 升到50℃ 時，未反應的包裹物量增加67%，說明包裹物與ONOO－的反應是放熱反應，低溫有利于反應的進行，這與Res／HP－CD包裹物與ONOO－反應的特點相同［18］.

2.5 CO2對Res／β－CD包裹物與過氧亞硝基相互作用影響

在血液中CO2濃度高達1.3mmol／L，為考查CO2的存在對Res／6mmol／Lβ－CD包裹物與ONOO－反應的影響，測定了在含25mmol／L碳酸鹽（與1.3mmol／L CO2相平衡）的緩沖液中 Res／6mmol／Lβ－CD 包裹物與 ONOO－反應，結果見圖5.

圖5 CO2 對Res／6mmol／Lβ－CD包裹物與ONOO－反應的影響Fig.5 Effects of CO2on the reaction of Res／6mmol／Lβ－CD with ONOO－

由圖5可知，當緩沖液中含碳酸鹽時，未反應的包裹物增加.CO2的存在對ONOO－的影響有兩方面：一是使ONOO－的半衰期從700ms變?yōu)?2 ms；二是與ONOO－反應，生成壽命更短的中間物ONOOCO2－，有約35%的中間物分解為·NO2和CO3·－自由基［22］，在此條件下包裹物與ONOOCO2－ 分解產生的CO3·－發(fā)生反應.由于CO3·－的反應活性不如ONOO－，因此未反應的包裹物量增加.

3 結論

β－CD可提高Res的水溶性，包裹后的Res同樣具有抗ONOO－作用，低溫有利于清除反應的進行.相比于其它CD，β－CD來源廣、價格低，更適合用于包裹 Res.而Res／β－CD包裹物可在治療由ONOO－引起的一系列疾病中發(fā)揮作用.

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Study on the reaction of Res／β－CD inclusion complex with peroxynitrite

LV Zhong，HUANG Huifang，ZHAO Huiping，HONG Dai，YANG Hao，CHEN Rong
（Key Laboratory for Green Chemical Process of Ministry of Education，Hubei Novel Reactor ＆ Green Chemical Technology Key Laboratory，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430073）

The utilization of anticancer and anticarcinogenesis drug resveratrol（Res）is limited by its poor solubility and stability.The limitation could be overcome by the formation of inclusion complexes withβ－cyclodextrin（β－CD）.The investigate results show that the solubility of Res increasing with increasedβ－CD concentration，the stoichiometric ratio of Res withβ－CD in the complex is 1∶1.The in－vitro experiment conforms that the Res／β－CD inclusion complex can reacts to peroxynitrite，which has strong oxidation and nitration.Lower temperature is benefits the above reaction.The existence of CO2can reduce the quantity of the Res／β－CD inclusion complex which reacts with peroxynitrite.

resveratrol；β－cyclodextrin；inclusion complex；peroxynitrite

Q754

A

1000－1190（2012）02－0180－04

2011－08－10.

武漢市科技局對外科技合作與交流計劃（201171034319，201070934342）；武漢工程大學青年科學基金項目（Q201104）；武漢工程大學“環(huán)境與化工清潔生產實驗教學示范中心”創(chuàng)新型實驗項目.

＊通訊聯系人.E－mail：rchenhku＠hotmail.com.