王曉萍，董聯(lián)紅，詹舒越

(浙江大學(xué)光電系現(xiàn)代光學(xué)儀器國家重點實驗室，杭州310027)

表面等離子體共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)檢測技術(shù)以其靈敏度高、所需試樣少、樣品無需標(biāo)記、響應(yīng)速度快、可實現(xiàn)實時監(jiān)控等特點，被廣泛應(yīng)用于生物、食品、醫(yī)療、環(huán)境等領(lǐng)域［1－6］。從 BiacoreTM(Uppsala Sweden)公司發(fā)布商業(yè)SPR儀器以來，SPR傳感器與檢測儀器得到飛速發(fā)展。目前，SPR傳感器和檢測儀器的主要發(fā)展方向是高靈敏、高分辨率、高通量、多通道及小型化［7－10］。對于最常見的角度調(diào)制型SPR傳感器和檢測儀器，其SPR共振角的確定方法對提高儀器信噪比和分辨率等指標(biāo)具有重要作用，因此研究快速有效的SPR共振角計算方法具有重要意義。

常用的SPR共振角計算方法有質(zhì)心法、多項式擬合法、特定反射率法、一階導(dǎo)數(shù)過零點法［11－12］等。其中，質(zhì)心法由于運算簡單、所需時間少，而得到廣泛應(yīng)用。目前對于質(zhì)心法的研究主要集中于如何進一步抑制噪聲、提高分辨率。Nenninger等［13］提出的固定寬度動態(tài)基線質(zhì)心法，Thirstrup等［14］提出的基于面積的動態(tài)基線質(zhì)心法，以及酈雅平等［15］提出的基于幅值的動態(tài)基線質(zhì)心法，均能有效抑制光源光強波動引起的SPR共振角波動;Johansen等［16］提出的加權(quán)質(zhì)心算法，可以提高分辨率。

本文提出了一種無基線質(zhì)心法，該方法具有運算速度快、受光源波動影響小、信噪比高、分辨率高等特點。對具有明顯光源光強波動的實驗數(shù)據(jù)和寬折射率范圍樣品的實驗數(shù)據(jù)，分別采用固定基線質(zhì)心法、基于幅值的動態(tài)基線質(zhì)心法以及本文提出的無基線質(zhì)心法進行分析研究，結(jié)果表明無基線質(zhì)心法運算簡單、不受光源波動影響，且具有較高的信噪比和分辨率。

1 算法描述

SPR共振角通常用SPR反射光譜共振點對應(yīng)的像素位置(共振像素)表示。質(zhì)心法首先要選定一條基線，然后按式(1)可求得該基線和SPR光譜曲線所構(gòu)圖形的質(zhì)心，并將質(zhì)心對應(yīng)的像素值作為共振像素。

式中i是像素值，i1和i2分別為基線與SPR光譜相交的第一像素點(起始像素)和第二像素點(終止像素)，Ri為像素i對應(yīng)的光譜值。

1．1 固定基線質(zhì)心法

固定基線質(zhì)心法的基線一般取SPR曲線約2/3深度的位置，其參數(shù)為基線的高度，如圖1所示，通常根據(jù)實驗數(shù)據(jù)來確定。該方法簡單，但光源波動引起的SPR光譜曲線的整體偏移會影響共振像素。如圖2所示，假設(shè)SPR光譜1受光源波動影響，正向移動數(shù)值0．2到SPR光譜2位置，由于被測介質(zhì)折射率沒變，所以SPR光譜的形狀不變。若采用固定基線1分別計算光譜1和光譜2的共振像素，由于兩光譜與基線1所構(gòu)圖形的面積不同，得到的質(zhì)心位置也不同，所以共振像素位置不同。由此可見，固定基線法易受光源波動的影響。

圖1 固定基線質(zhì)心法與無基線質(zhì)心法示意圖

圖2 光源光強波動對固定基線、動態(tài)基線、無基線質(zhì)心法的影響效果

1．2 動態(tài)基線質(zhì)心法

動態(tài)基線質(zhì)心法的基線隨著SPR光譜的變化而變化，如圖2所示。當(dāng)光譜1因光強波動偏移到光譜2位置時，基線也動態(tài)變化到基線2位置。分別計算基線2與光譜2所構(gòu)圖形以及基線1與光譜1所構(gòu)圖形的質(zhì)心，由于兩圖形面積基本相等，質(zhì)心位置也基本相同，所以共振像素位置基本不變。由此可見，動態(tài)基線質(zhì)心法對光源波動不敏感，但其計算過程比固定基線法稍為復(fù)雜。對于引言中介紹的三種動態(tài)基線質(zhì)心法，基于幅值的動態(tài)基線法相比其它兩種動態(tài)基線法，不僅受光源波動影響小，而且更加簡單快速。所以本文采用基于幅值的動態(tài)基線法作為對比算法，該方法依據(jù)基線位于SPR曲線約2/3高度的原則，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)確定其算法參數(shù)—幅值比［15］。

1．3 無基線質(zhì)心法

本文提出的無基線質(zhì)心法，是通過計算如圖1所示陰影部分的質(zhì)心，來確定共振像素，其參數(shù)為起始像素和終止像素。根據(jù)這兩個參數(shù)確定的左右邊界與SPR光譜及像素坐標(biāo)軸構(gòu)成的圖形，再利用式(2)［17］計算得到其質(zhì)心和像素。

起始像素和終止像素根據(jù)實驗數(shù)據(jù)確定，對于窄折射率范圍樣品實驗，起始像素和終止像素對應(yīng)的反射率要求在SPR曲線約2/3的高度位置;而對于寬折射率范圍樣品實驗，由于共振像素變化范圍較大，為準(zhǔn)確獲得寬折射率范圍樣品的SPR光譜共振像素，所選像素范圍也應(yīng)變寬。

討論光源波動對該算法的影響，如圖2所示，當(dāng)光譜1變到光譜2時，左右垂直邊界線與光譜2及像素坐標(biāo)軸構(gòu)成的圖像只是在光譜1對應(yīng)圖形基礎(chǔ)上增加一個矩形。當(dāng)光源波動引起SPR光譜偏移時，矩形的寬度沒有改變，兩個矩形的質(zhì)心對應(yīng)的像素保持不變，整體共振像素位置基本不受影響。因此，該算法計算共振像素不受光源波動影響，可有效抑制噪聲。

2 實驗研究

2．1 材料與試劑

實驗材料包括SpreetaTM傳感器(128像素線陣CCD，Texas Instruments Inc．，USA)、HPLC 進樣閥(C4 －1004 －．5，Valco Instruments Inc．，Switzerland)、HPLC 泵(UC－3281，北京優(yōu)聯(lián)光電科技公司)、工業(yè)注射泵(MSP1－C1，中國保定蘭格公司)、十通選擇閥(EMHMA-CE，Valco Instruments Inc．，Switzerland)和阿貝折射率儀(上海申光儀器公司)，樣品為中國醫(yī)藥集團的氯化鈉(NaCl，分析純)和蔗糖(C12O22H11，分析純)。

2．2 實驗方法

雙重蒸餾水作為溶劑配制NaCl標(biāo)準(zhǔn)溶液:濃度分別為 0．1 mg/mL、0．2 mg/mL、0．3 mg/mL、0．4 mg/mL、0．5 mg/mL、1 mg/mL;蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液:濃度分別為 0．1%、0．2%、0．4%、0．6%、0．8%、1%、2%、4%、6%、8%、10%。同時雙重蒸餾水也作為緩沖液。

由HPLC進樣閥和HPLC泵構(gòu)成NaCl溶液實驗的SPR進樣系統(tǒng)，由十通選擇閥和工業(yè)注射泵構(gòu)成蔗糖溶液實驗的SPR進樣系統(tǒng)，SpreetaTMSPR傳感器輸出的SPR光譜數(shù)據(jù)，由計算機采集處理。實驗時，NaCl標(biāo)準(zhǔn)溶液和蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液從低濃度到高濃度分別檢測了4次和3次。

3 結(jié)果與分析

3．1 運算速度

對NaCl標(biāo)準(zhǔn)溶液的23 429組光譜數(shù)據(jù)，分別采用固定基線質(zhì)心法、動態(tài)基線質(zhì)心法和無基線質(zhì)心法計算SPR共振像素，它們的平均運算時間分別為0．81 s和 0．83 s 和 0．70 s。對蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的108 259組光譜數(shù)據(jù)，也采用三種質(zhì)心法計算，所需的平均運算時間分別為 3．50 s、3．55 s 和 3．20 s。結(jié)果表明，無基線質(zhì)心法具有最快的運算速度。

3．2 NaCl溶液實驗結(jié)果與分析

在低濃度NaCl溶液檢測實驗中，光源噪聲表現(xiàn)明顯。用三種質(zhì)心法處理光譜數(shù)據(jù)時，也結(jié)合運用平方加權(quán)算法以減小結(jié)果的線性偏差［16］。根據(jù)三種質(zhì)心法最佳參數(shù)的確定原則，得到固定基線質(zhì)心法的基線值是0．85，幅值動態(tài)基線法基線高度比是0．35，無基線質(zhì)心法的像素范圍是65到97，運用三種質(zhì)心法計算獲得的SPR傳感監(jiān)控圖(共振像素隨時間的變化)如圖3(a)～圖3(c)。從圖可見，固定基線法受光源波動等因素影響明顯，另兩種質(zhì)心法受光源波動影響明顯較小。

進一步分析它們的信噪比(SNR)，以每個濃度對應(yīng)的四個檢測峰的平均值作為信號，峰值之前蒸餾水緩沖液信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差平均值作為噪聲，三種算法的信噪比－樣品濃度的線性擬合曲線如圖3(d)所示。由圖可見，無基線質(zhì)心法具有較高的信噪比。

圖3 NaCl溶液實驗SPR監(jiān)控圖及分析結(jié)果

3．3 蔗糖溶液實驗結(jié)果和性能指標(biāo)

同樣根據(jù)三種質(zhì)心法最佳參數(shù)的確定原則，得到固定基線質(zhì)心法的基線值是0．63，幅值動態(tài)基線法的基線高度比是0．33;由于蔗糖溶液濃度范圍寬，使得SPR共振像素變化范圍較大，因此無基線質(zhì)心法的像素范圍確定為27到112。

與NaCl實驗分析方法相似，首先運用三種質(zhì)心法計算獲得SPR傳感監(jiān)控圖如圖4(a)～圖4(c)，再根據(jù)監(jiān)控圖可得到三種方法信噪比的二階多項式擬合曲線，如圖4(d)所示。由圖可見，無基線質(zhì)心法具有較高的信噪比。

運用阿貝折射率儀分別測量濃度為0%、1%、2%、4%、6%、8%和10%的蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到它們的折射率為 1．332 0、1．333 5、1．335 0、1．337 9、1．340 6、1．343 4 和1．346 4。對這些數(shù)據(jù)進行線性擬合可得到濃度與折射率的校準(zhǔn)方程RI=1．332 08+0.142 75×C，據(jù)此方程可計算出濃度為0．1%、0．2%、0．4%、0．6%和0．8%的蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的折射率分別為1．332 2、1．332 4、1．332 7、1．332 9 和1．333 2。

圖4 蔗糖溶液實驗SPR監(jiān)控圖及分析結(jié)果

根據(jù)各濃度蔗糖溶液的共振像素(P)和各濃度蔗糖溶液對應(yīng)的折射率(R)，運用二階多項式擬合得到共振像素—折射率校準(zhǔn)(P－R)曲線如圖5所示。實際樣品測量時，根據(jù)SPR檢測到的共振像素以及該P－R校準(zhǔn)曲線，可以得到樣品的折射率。

圖5 三種算法對應(yīng)的共振像素－折射率校準(zhǔn)曲線

根據(jù)靈敏度(SRI)的定義dP/dR，以及P－R的二次校準(zhǔn)方程(曲線)，靈敏度是一個與R有關(guān)的變量。在選取R=1．3320時，三種質(zhì)心法的靈敏度分別為2 530．906，2 535．495 和1 577．654 Pixel/RIU。

折射率分辨率(σRI)的定義為，其中為噪聲水平。以監(jiān)控圖峰值之前緩沖液信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均值作為噪聲，三種質(zhì)心法的噪聲分別為0．001 072，0．000 887 和 0．000 484，結(jié)合上面得到的靈敏度SRI，可以得到三種質(zhì)心法的分辨率分別為4．24，3．50，3．07×10－7RIU。結(jié)果表明無基線質(zhì)心法的分辨率最高。

從蔗糖溶液實驗可知，無基線質(zhì)心法的靈敏度比其它兩種方法小，信號響應(yīng)值略低，但噪聲抑制程度比其它兩種方法大，所以信噪比和分辨率比其它兩種方法略高一些?？梢娫撍惴ㄔ谶x取合理參數(shù)條件下，能有效抑制噪聲水平，在提高運算速度的同時，信噪比和分辨率略優(yōu)于其它兩種方法，在窄折射率范圍和寬折射率范圍的檢測實驗中均可使用。

4 結(jié)論

提出并研究了一種SPR共振角的快速計算方法。對多種質(zhì)量濃度的氯化鈉和蔗糖溶液的SPR光譜數(shù)據(jù)，分別運用固定基線質(zhì)心法、基于幅值的動態(tài)基線質(zhì)心法和無基線質(zhì)心法計算共振像素，得到三種方法的SPR監(jiān)控曲線。分析結(jié)果表明，無基線質(zhì)心法不僅對光源波動不敏感，而且在運算速度、信噪比、分辨率等方面都具有一定優(yōu)勢。在自行開發(fā)的SPR檢測系統(tǒng)中加以應(yīng)用，體現(xiàn)出該方法對提高SPR檢測系統(tǒng)的性能指標(biāo)具有重要作用。后續(xù)將在自行研制的多通道SPR傳感器中，運用該方法進行數(shù)據(jù)處理和分析，進一步明確方法參數(shù)的確定原則。

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