摘要：【目的】為了建立柑橘黃龍病菌亞洲種LAMP快速檢測方法?！痉椒ā扛鶕?jù)黃龍病菌亞洲種外膜蛋白基因，在種屬特異保守區(qū)域的6個位點設(shè)計2對特異性引物，對反應(yīng)條件和體系進行優(yōu)化，并通過產(chǎn)物沉淀觀察和SYBR Green I熒光染料顯色的方法來快速判讀檢測結(jié)果。同時對田間樣品進行了特異性和靈敏度分析試驗?！窘Y(jié)果】該方法僅需63 ℃反應(yīng)70 min即可得到結(jié)果，特異性強，靈敏度高。對柑橘常見病害樣品進行LAMP擴增，僅HLB陽性樣品擴增產(chǎn)物電泳呈特征性梯狀條帶。檢測靈敏度比常規(guī)PCR高100倍，與實時定量PCR相當(dāng)。在對105份黃龍病田間疑似樣品檢測中，LAMP陽性檢出率為52.4%，常規(guī)PCR為37.1%，2種檢測方法符合率為84.7%。【結(jié)論】建立的黃龍病菌亞洲種LAMP檢測方法，快速簡便、特異性強、靈敏度高，為快速檢測柑橘黃龍病提供了新方法和新思路。

關(guān)鍵詞： 柑橘黃龍病菌亞洲種； 外膜蛋白基因； 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)

柑橘黃龍?。–itrus Huanglongbing， HLB）是世界柑橘生產(chǎn)上最具毀滅性的病害之一，是國內(nèi)外植物檢疫對象。目前主要分布在亞洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的近50個國家和地區(qū)，中國19個柑橘生產(chǎn)?。ㄊ小⒆灾螀^(qū)）中已有11個受到該病危害，嚴重制約柑橘產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。其病原物暫定為α-變形菌綱韌皮部桿菌屬（Candidatus Liberibacter），包括亞洲種（‘Ca. L. asiaticus’）、非洲種（‘Ca. L. africanus’）和美洲種（‘Ca. L. americanus’）[1-2]，在我國該病害主要由亞洲種引起[3]。田間癥狀表現(xiàn)為病樹的黃梢和葉片的斑駁型黃化，果實小，畸形，嚴重影響柑橘的品質(zhì)與產(chǎn)量。由于目前缺乏有效藥劑和抗病品種，主要采取砍除病樹、防治木虱和種植無病苗木等防控措施，因此加強柑橘黃龍病的早期診斷顯得尤為重要。傳統(tǒng)的指示植物[4]、電鏡[5]和血清學(xué)[6]等診斷方法不僅費時費力，而且效率低；近年，常規(guī)PCR[7]、巢式PCR [8]和實時定量PCR[9-10]已應(yīng)用到柑橘黃龍病的檢測上，但是 PCR 檢測技術(shù)需要特殊儀器設(shè)備且檢測成本較高，不適合在田間大規(guī)模快速應(yīng)用，因此，在加強柑橘苗木檢疫監(jiān)測中，迫切需要一種成本低廉、操作簡便、結(jié)果判斷快速、靈敏度高和特異性強的柑橘黃龍病檢測方法。

日本學(xué)者Notomi等[11]于2000年開發(fā)了一種新型的恒溫核酸擴增方法，即環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法（Loop-mediated isothermal amplification， LAMP）。該技術(shù)針對靶基因的6個特定區(qū)域設(shè)計4條特異引物，借助具有鏈置換作用的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase），在等溫條件下進行靶序列高效擴增。它避免了常規(guī) PCR 溫度循環(huán)的特殊要求，因其簡便、高效，成本低、檢測周期短等優(yōu)點，具有較高的應(yīng)用價值。LAMP檢測技術(shù)已廣泛應(yīng)用于臨床、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，目前在植物中主要集中在植物病毒、細菌、真菌性病害及轉(zhuǎn)基因作物的檢驗檢疫工作中[12-15]，具有較大的開拓空間。因此，我們主要運用LAMP技術(shù)，建立一種柑橘黃龍病的快速檢測方法。

1 材料和方法

1.1 供試材料

從我國7省（市、區(qū)）收集黃龍病疑似樣品，大部分由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所國家苗木脫毒中心田間調(diào)查采集，少量樣品由現(xiàn)代柑橘產(chǎn)業(yè)體系綜合試驗站和各地植保植檢系統(tǒng)工作人員提供，所有樣品4 ℃保存?zhèn)溆?。潰瘍病、黑星病、炭疽病和褐斑病等柑橘病害的DNA模板在國家苗木脫毒中心實驗室-20 ℃保存。

1.2 主要試劑

Bst DNA聚合酶購自北京紐英倫生物技術(shù)有限公司；氯化鉀、硫酸銨和硫酸鎂等購自Sigma公司；10000×SYBR Green I購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Trans1-T1 Phage Resistant 化學(xué)感受態(tài)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Ssp I限制性內(nèi)切酶、DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量和PCR相關(guān)試劑購自Takara和Promega公司。

1.3 DNA的提取

利用CTAB法提取柑橘葉脈基因組DNA，提取方法參照Murray等[16]方法，樣品-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 LAMP引物的設(shè)計

根據(jù)NCBI公布的‘Ca. L. asiaticus’基因組的外膜蛋白基因保守序列（Genbank登錄號：AY842429），利用PrimerExplorer V4在線軟件（http：//primerexplorer.jp/e/）在種屬特異保守區(qū)域設(shè)計外引物對（F3和B3）和內(nèi)引物對（FIP和BIP）；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。序列信息見表1。

1.5 LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化

分別對反應(yīng)體系（Mg2+、dNTPs、Betaine、omp-FIP/BIP和omp-F3/B3的濃度等）和反應(yīng)條件（反應(yīng)溫度和時間）進行優(yōu)化，每個因子設(shè)置3個重復(fù)試驗。Mg2+終濃度分別為0、2、4、6、8、10、12、14 mmol·L-1；dNTPs終濃度分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol·L-1；甜菜堿（Betaine）終濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mol·L-1； omp-FIP/BIP終濃度分別為0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 μmol·L-1；omp-F3/B3終濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4 μmol·L-1；反應(yīng)溫度采用57、59、61、63、65 ℃依次遞增；反應(yīng)時間分別采用10、20、30、40、50、60、70、80、90 min。在25 μL反應(yīng)體系中，5×Reaction Buffer[100 mmol·L-1 Tris-HCl pH 8.8、50 mmol·L-1 KCl、50 mmol·L-1 （NH4）2SO4、0.5% Tween 20]、Bst DNA 聚合酶8 U、模板1.0 μL、加ddH2O補足至25 μL，混勻，于65 ℃水浴鍋中反應(yīng)80 min，之后80 ℃下滅活5 min結(jié)束反應(yīng)，取5 μL 反應(yīng)產(chǎn)物上樣于2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，以確定最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。

1.6 LAMP特異性檢測及其產(chǎn)物內(nèi)切酶鑒定

采用優(yōu)化后的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，以柑橘黃龍病、潰瘍病、黑星病、炭疽病、褐斑病及健康樣品DNA為模板，以雙蒸水代替DNA模板作空白對照進行LAMP反應(yīng)，檢測該方法的特異性。取LAMP 產(chǎn)物4.0 μL，加10×Ssp I Basal Buffer 2.0 μL、Ssp I限制性內(nèi)切酶1.0 μL、加ddH2O至總體積20 μL，37 ℃ 反應(yīng)4 h 后取8 μL 酶切產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳，經(jīng)10 g·L-1溴化乙錠（EB）染色后，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，LAMP 產(chǎn)物經(jīng)Ssp I 酶切，理論上酶切產(chǎn)物為70 bp和133 bp。

1.7 LAMP與實時定量PCR和常規(guī)PCR靈敏度的比較

將純化的PCR產(chǎn)物直接與pMD19-T載體16 ℃連接過夜，重組T載體轉(zhuǎn)化Trans1-T1 Phage Resistant化學(xué)感受態(tài)，用Plasmid Mini Kit提取重組質(zhì)粒DNA，核酸濃度測定儀測定其D 260nm/D 280nm值，計算樣本DNA的拷貝數(shù)，取1.0 μL提取的質(zhì)粒DNA，并做10倍梯度稀釋，用于檢測LAMP方法的靈敏度。實時定量PCR和常規(guī)PCR的靈敏度試驗均采用LAMP的2條外引物（omp-F3和omp-B3）。25 μL實時定量PCR反應(yīng)體系為：2×SYBR Premix ExTaqTMⅡ12.5 μL，5 μmol·L-1 omp-F3/B3混合物1.0 μL，模板1.0 μL，加ddH2O補足到25 μL。擴增程序為：95 ℃預(yù)變性30 s；PCR反應(yīng)95 ℃ 5 s，63 ℃ 30 s，40個循環(huán)，在63 ℃同步采集熒光；熔解曲線過程為95 ℃ 15 s，65 ℃ 15 s，從65 ℃開始每個循環(huán)升高0.5 ℃，連續(xù)升高60次（到95 ℃為止）。 25 μL 常規(guī)PCR反應(yīng)體系為：10×Buffer 2.5 μL，25 mmol·L-1 MgCl2 2 μL，10 mmol·L-1 dNTPs 0.3 μL，5 μmol·L-1 omp-F3/B3混合物1.0 μL，5 U·μL-1 r Taq DNA聚合酶0.3 μL，模板1.0 μL，加ddH2O補足到25 μL。擴增程序為：95 ℃ 預(yù)變性2 min，95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸12 s，35個循環(huán)后，72 ℃延伸5 min。預(yù)期片段大小為194 bp，取擴增產(chǎn)物6.5 μL，在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，經(jīng)EB染色后，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。以上試驗，均設(shè)置至少3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.1.1 反應(yīng)體系的優(yōu)化 優(yōu)化后的反應(yīng)體系 （25 μL） 確定為：8 mmol·L-1 Mg2+、1.2 mmol·L-1 dNTPs、1.6 μmol·L-1 omp-FIP/BIP、0.2 μmol·L-1 omp-F3/B3、Bst DNA 聚合酶8 U、5×Reaction Buffer，模板DNA 1.0 μL。根據(jù)實驗結(jié)果，甜菜堿濃度的逐步增加，對擴增結(jié)果未見明顯變化，因此確定不需要添加甜菜堿。

2.1.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化 反應(yīng)溫度。用優(yōu)化后的反應(yīng)體系對反應(yīng)溫度進行最適選擇，當(dāng)溫度在57 ℃時，未見梯狀擴增條帶，當(dāng)溫度在59 ℃、61 ℃、63 ℃和65 ℃時，擴增條帶逐漸變得明亮清晰（圖1）。因此，選擇63 ℃作為LAMP反應(yīng)的最佳反應(yīng)溫度。

反應(yīng)時間。當(dāng)反應(yīng)30 min后，開始出現(xiàn)微弱擴增條帶，隨著時間的延長，條帶逐漸明亮清晰，當(dāng)反應(yīng)到70 min左右時，能檢測到3.9×101拷貝的質(zhì)粒DNA模板（圖2）。因此，選擇70 min作為LAMP反應(yīng)的最佳反應(yīng)時間。

2.2 LAMP擴增產(chǎn)物的分析

反應(yīng)結(jié)束后，擴增產(chǎn)物可以通過瓊脂糖凝膠電泳，獲取電泳圖譜，出現(xiàn)特征性梯狀條帶為陽性，未出現(xiàn)特征性梯狀條帶為陰性（圖版-A）；也可以通過觀察濁度或者短暫離心觀察沉淀，出現(xiàn)白色渾濁或白色沉淀即為陽性，否則為陰性（圖版-B）；若在反應(yīng)液中加入1000×SYBR Green I顯色液，出現(xiàn)綠色表明為陽性，橙色則表明為陰性（圖版-C）。結(jié)果表明，LAMP產(chǎn)物采用瞬時離心觀察焦磷酸鎂白色沉淀和SYBR Green I熒光染料顯色，結(jié)果與電泳一致。

2.3 LAMP特異性檢測及其產(chǎn)物內(nèi)切酶鑒定

以優(yōu)化的LAMP檢測體系對柑橘黃龍病、潰瘍病、黑星病、炭疽病、褐斑病及健康樣品進行LAMP擴增反應(yīng)，只有HLB DNA模板有特異性擴增條帶，而其他模板均未見擴增條帶（圖3-A），表明LAMP方法特異性強。LAMP產(chǎn)物經(jīng)Ssp I限制性內(nèi)切酶酶切后得到大約70 bp和133 bp的條帶（圖3-B），酶切產(chǎn)物與理論值相符。

2.4 LAMP與實時定量 PCR和常規(guī)PCR靈敏度的比較

采用LAMP和實時定量PCR進行檢測時，質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)為3.9×101的模板仍可以擴增，而常規(guī)PCR在質(zhì)?？截悢?shù)為3.9×103時，才得到微弱的擴增條帶（圖版-D～H）。表明LAMP方法與實時定量PCR檢測靈敏度相當(dāng)，但比常規(guī)PCR高100倍。

2.5 田間樣品的應(yīng)用檢測

應(yīng)用建立的LAMP方法對105份黃龍病田間疑似樣品進行檢測，并與常規(guī)PCR方法比較。結(jié)果表明，LAMP檢出55份陽性，陽性率為52.4%，其中有39份用PCR方法檢測也為陽性，陽性率為37.1%，2種檢測方法符合率為84.7%（表2）。

3 討 論

本研究基于外膜蛋白靶基因，建立并優(yōu)化了柑橘黃龍病菌亞洲種LAMP快速檢測方法。針對本套引物，Mg2+濃度在8 mmol·L-1時反應(yīng)條帶最佳，與之前文獻報道的Mg2+最佳濃度為8 mmol·L-1相一致[17-18]，引物和dNTPs濃度對反應(yīng)體系的影響差異不顯著。有報道表明添加甜菜堿有助于保持Bst DNA聚合酶的活性和穩(wěn)定性，使雙鏈 DNA 處于不穩(wěn)定狀態(tài)，減少堿基的堆積，從而提高 LAMP 擴增效率[11]，因此本研究對LAMP反應(yīng)體系中甜菜堿的作用和最適濃度作進一步探索，但結(jié)果表明該體系不需要添加甜菜堿即可獲得高效擴增。應(yīng)用建立的LAMP技術(shù)對柑橘田間樣品進行擴增，僅HLB樣品為陽性，并對其產(chǎn)物進行酶切鑒定，均表明該方法具有較強的特異性。在靈敏度分析試驗中，該方法最低檢出量為3.9×101拷貝，與實時定量PCR檢測結(jié)果一致，但比常規(guī)PCR高100倍；在對105份黃龍病田間疑似樣品檢測中，LAMP和常規(guī)PCR檢測結(jié)果符合率為84.7%，這些差異進一步證明了LAMP的靈敏度要高于常規(guī)PCR方法。最近，Mao等[19] 和Li等[20]應(yīng)用LAMP檢測相關(guān)樣品，其靈敏度比常規(guī)PCR高10倍或100倍以上。由此可見，在靈敏度上表現(xiàn)差異的原因目前尚不清楚，可能是由于引物的擴增效率，也可能是擴增體系的優(yōu)化問題，或者是不同研究對象DNA樣品中某些物質(zhì)抑制了反應(yīng)的高效擴增，因此，對優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件最佳因子的選擇不可一概而論。

Okuda等[21]于2005年在黃龍病菌亞洲種的nus G-rplKAJL-rpoB基因簇區(qū)和16S rDNA基因區(qū)設(shè)計了兩組引物，其中以16S rDNA基因區(qū)為靶基因的引物擴增產(chǎn)生非特異性條帶，因此應(yīng)用nusG-rplKAJL-rpoB基因簇區(qū)建立了黃龍病菌亞洲種的LAMP檢測技術(shù)，其結(jié)果顯示，檢測靈敏度只能檢出近300個基因拷貝，與常規(guī)PCR一致。而本研究基于黃龍病菌亞洲種omp基因保守位點設(shè)計引物并建立的黃龍病LAMP檢測方法，靈敏度明顯比其高出一個數(shù)量級，并且對反應(yīng)體系和反應(yīng)條件相關(guān)因子進行了優(yōu)化組合，建立了更加靈敏特異的檢測技術(shù)。這種差異的產(chǎn)生，極大可能是由于引物的設(shè)計及體系優(yōu)化所致，因此，對引物，特別是內(nèi)引物的長度、內(nèi)引物之間的距離、二級結(jié)構(gòu)、G+C含量、Tm值等都要有嚴格的要求，盡可能接近引物設(shè)計理論值。設(shè)計高擴增效率的引物，利于提高LAMP檢測病菌的靈敏度。該方法與常規(guī)PCR相比較，從DNA抽提到結(jié)果的判斷，僅約1.5 h，大大縮短了檢測時間。LAMP反應(yīng)結(jié)束后，直接短暫離心觀察焦磷酸鎂白色沉淀[17，22]或添加熒光染料SYBR Green I于可見光或紫外光下觀察顏色變化[13，23-24]，可不通過電泳直接快速判讀結(jié)果，特別適合普通實驗室及現(xiàn)場的大批量樣品檢測。

4 結(jié) 論

研究建立的柑橘黃龍病LAMP快速檢測技術(shù)，特異性強、靈敏度高、方便簡捷、成本低廉，無需電泳及特殊儀器設(shè)備，特別適合田間樣品快速檢測。為柑橘黃龍病的檢測提供了新的思路，有望成為簡易的常規(guī)檢測手段。（本文圖版見插3）

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