摘要：【目的】通過(guò)構(gòu)建蘋果栽培品種的SSR標(biāo)記指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)蘋果品種的快速、準(zhǔn)確鑒定?！痉椒ā恳試?guó)內(nèi)外40個(gè)主要栽培品種為試驗(yàn)材料，選用均勻分布于17條染色體上的144對(duì)SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并采用6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳與SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳相結(jié)合的方法進(jìn)行檢測(cè)?！窘Y(jié)果】結(jié)果表明，從144對(duì)SSR引物中篩選出了35對(duì)多態(tài)性較高、譜帶清晰的引物，35對(duì)引物共檢測(cè)到314個(gè)等位基因，每對(duì)SSR引物擴(kuò)增出等位基因數(shù)3～15個(gè)，平均8.97個(gè)；多態(tài)性信息含量指數(shù)（PIC）變化為0.455 3～0.834 6，平均為0.692 0；各個(gè)位點(diǎn)的雜合度在0.475 0～1.000 0，平均為0.794 3；標(biāo)記系數(shù)（MI）平均為6.208 0，其中CH04c10引物對(duì)蘋果基因組DNA變異檢測(cè)最有效，其多態(tài)性信息含量指數(shù)和標(biāo)記指數(shù)均最高，分別為0.834 6和12.519 0。 以CH03d07、NZ02b1和CH05c04這3對(duì)引物進(jìn)行組合鑒定，即可將40個(gè)蘋果品種完全區(qū)分開。與6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)方法相比，熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測(cè)能更準(zhǔn)確讀出目標(biāo)片段的大小，檢測(cè)效果更為理想，更適合于DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)的建立。【結(jié)論】將2種檢測(cè)方法結(jié)合構(gòu)建蘋果品種DNA指紋圖譜，結(jié)果更準(zhǔn)確、更可靠。

關(guān)鍵詞：蘋果； SSR標(biāo)記； 熒光標(biāo)記； 指紋圖譜

中圖分類號(hào)：Ｓ６６1．1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：Ａ 文章編號(hào)：１００９－９９８０?穴２０12?雪０6－971－０7

DNA指紋圖譜具有多位點(diǎn)性、高變異性和簡(jiǎn)單穩(wěn)定的遺傳性，因而自其誕生就引起了人們的重視，表現(xiàn)出巨大的實(shí)用價(jià)值[1]。國(guó)內(nèi)外對(duì)于利用DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行品種鑒定極為重視。英國(guó)、德國(guó)、荷蘭、法國(guó)、西班牙等五國(guó)于1997年啟動(dòng)了一項(xiàng)利用簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行小麥、西紅柿等主要作物品種鑒定的項(xiàng)目，制定了統(tǒng)一的利用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行品種鑒定的方法標(biāo)準(zhǔn)[2]。北京農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心已建成了基于SSR標(biāo)記技術(shù)的玉米指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)[3]，包含的玉米品種數(shù)量已達(dá)5 000余份。國(guó)際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟（UPOV）已將SSR標(biāo)記技術(shù)和單核苷酸多態(tài)性技術(shù)（SNP）推薦為適合構(gòu)建指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)的2種技術(shù)，認(rèn)為SSR標(biāo)記技術(shù)是目前最為成熟的技術(shù)[4]。

目前建立作物的SSR指紋圖譜的方法多采用瓊脂糖、普通聚丙烯酰胺凝膠、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、TP-M13-SSR技術(shù)[5-6]和常規(guī)熒光SSR技術(shù)。從分辨率上看，非變性聚丙烯酰胺凝膠均不能分辨大小在2個(gè)堿基對(duì)以內(nèi)的差異，瓊脂糖凝膠分辨率更低；而變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合放射自顯影、銀染等手段能夠分辨最小為1個(gè)堿基對(duì)的差異，能夠分辨同一SSR位點(diǎn)上的不同等位基因，完全滿足構(gòu)建指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)等位基因大小分辨率的要求?；贒NA測(cè)序儀的SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法可以得到定量的DNA片段分析數(shù)據(jù)，與常規(guī)的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)方法相比，毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果更為精確、靈敏、高效，更適用于大批量品種的檢測(cè)分析[7]。因此利用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)與SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法相結(jié)合的方法進(jìn)行蘋果品種DNA指紋鑒定，方法可行、結(jié)果可靠[8]。

蘋果屬種質(zhì)資源豐富、種類多、分布廣，且利用歷史悠久，在果樹栽培、生產(chǎn)和育種上經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高[9-10]。隨著果樹育種技術(shù)的不斷發(fā)展，新培育出的蘋果栽培品種越來(lái)越多，保證品種的真實(shí)性、維護(hù)生產(chǎn)者與育種家的權(quán)益顯得日趨重要。而蘋果多用無(wú)性繁殖，樹體基因型高度雜合，極易造成同物異名或同名異物現(xiàn)象，鑒別起來(lái)較困難。以往對(duì)品種鑒別主要靠形態(tài)指標(biāo)，但對(duì)于差異并不明顯的個(gè)體，傳統(tǒng)的形態(tài)特征很難識(shí)別，而利用SSR分子標(biāo)記對(duì)品種進(jìn)行鑒定和分類[11-12]，是一種簡(jiǎn)單準(zhǔn)確而且可靠的方法。因此構(gòu)建蘋果SSR指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)蘋果品種鑒別具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.5 電泳數(shù)據(jù)分析 使用Genemapper4.0軟件收集原始數(shù)據(jù)，再利用Power Marker V3.25對(duì)供試材料進(jìn)行分析。最后將2種方法獲得的等位基因數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，對(duì)比與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增體系與引物退火溫度

2.2 核心引物的篩選及SSR多態(tài)性

選用均勻分布在蘋果17條染色體上的144對(duì)SSR引物，利用8份蘋果材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)，并對(duì)PCR擴(kuò)增體系與引物退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，篩選出35對(duì)多態(tài)性高、譜帶清晰的引物。然后利用這35對(duì)引物對(duì)40份材料擴(kuò)增，分別進(jìn)行6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)與SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測(cè)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后得到40份材料在35個(gè)位點(diǎn)的數(shù)據(jù)（表3）35對(duì)引物共檢測(cè)到314個(gè)等位基因，每對(duì)SSR引物擴(kuò)增出等位基因數(shù)3~15個(gè)，平均8.97個(gè)；多態(tài)性信息含量指數(shù) （PIC）變化為0.455 3~0.834 6，平均為0.692 0；各個(gè)位點(diǎn)的雜合度在0.475 0~1.000 0，平均為0.794 3；標(biāo)記系數(shù)（MI）平均為6.208 0，其中CH04c10引物對(duì)蘋果基因組DNA變異檢測(cè)最有效，其多態(tài)性信息含量指數(shù)和標(biāo)記指數(shù)均最高，分別為0.834 6和12.519 0。在所選35對(duì)引物中PIC＞0.5的高度多態(tài)性信息引物33對(duì)，0.25＜PIC＜0.5的中度多態(tài)性信息引物2對(duì)（CH01f09， 0.4622; Hi03e03， 0.455 3）。

2.3 指紋圖譜分析

2.4 多重毛細(xì)管電泳檢測(cè)與變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)對(duì)比

3 討 論

從研究蘋果指紋圖譜PCR擴(kuò)增體系的優(yōu)化過(guò)程可知SSR對(duì)反應(yīng)體系要求非常嚴(yán)格，尤其是對(duì)蘋果這種高度雜合的物種，在反應(yīng)體系中引物和Mg2+2種成分含量變化對(duì)擴(kuò)增條帶影響較大[13-15]，引物、Mg2+濃度增加均會(huì)導(dǎo)致大量非特異性條帶的出現(xiàn)，而基于SSR方法所建立的指紋圖譜要求所擴(kuò)增的條帶穩(wěn)定性與特異性高，因此對(duì)PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化是完成指紋圖譜建立的前提。本研究通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)探索出一套穩(wěn)定適用于蘋果SSR擴(kuò)增的體系與程序，為后續(xù)工作的進(jìn)行奠定了基礎(chǔ)。

選擇合適的引物是構(gòu)建蘋果分子指紋圖譜的另一重要前提[16-17]，本研究選取的144對(duì)SSR引物均勻位于蘋果17對(duì)染色體上。在144對(duì)SSR引物進(jìn)行多次篩選的基礎(chǔ)上，篩選出35對(duì)多態(tài)性高、重復(fù)性好的引物進(jìn)行圖譜構(gòu)建。從數(shù)據(jù)分析中發(fā)現(xiàn)，不同的引物對(duì)品種間多態(tài)性的鑒別能力有較大差異，無(wú)任何一個(gè)引物可以完全區(qū)分40個(gè)品種。而將35個(gè)核心引物分別進(jìn)行合理的3~4對(duì)引物組合后發(fā)現(xiàn)，每個(gè)組合可以將所有供試材料區(qū)分開，因此通過(guò)不同引物的有限組合，可以大大提高引物的鑒別能力。而隨著品種數(shù)量的進(jìn)一步增加，引物的組合基數(shù)便進(jìn)一步加大，而世界上的蘋果栽培品種有幾千種，對(duì)于所有的蘋果主栽品種或出現(xiàn)新品種時(shí)，難免會(huì)出現(xiàn)同一引物在不同品種間出現(xiàn)相同譜帶的現(xiàn)象，此時(shí)應(yīng)采用不同的核心引物組合或者篩選新的SSR引物將其區(qū)分開，以補(bǔ)充和擴(kuò)展現(xiàn)已建立的初步指紋圖譜。

在采用SSR聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)方法構(gòu)建蘋果品種DNA數(shù)據(jù)庫(kù)的工作中，如何準(zhǔn)確地整合不同批次、不同膠塊的蘋果品種DNA指紋鑒定數(shù)據(jù)一直是個(gè)難題[18]。為了保證蘋果品種DNA指紋圖譜方法的可行性與結(jié)果的可靠性，本研究采用了6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)方法與SSR標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法相結(jié)合進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果證明2種方法檢測(cè)到的等位基因數(shù)目和各實(shí)驗(yàn)材料對(duì)應(yīng)的等位基因類型基本一致，而個(gè)別品種經(jīng)2種方法檢測(cè)到的等位基因數(shù)目存在差異主要是由于熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測(cè)與常規(guī)的凝膠電泳檢測(cè)方法相比，數(shù)據(jù)更為精確所致。

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