摘要： 【目的】為了觀察‘新高’梨花粉母細胞減數(shù)分裂及花粉發(fā)育過程，探討‘新高’梨花粉敗育的細胞學基礎，【方法】以雄性不育的‘新高’和可育的‘豐水’梨為試材，采用常規(guī)壓片法觀察花粉母細胞減數(shù)分裂和花粉發(fā)育過程?！窘Y果】結果表明，‘新高’梨花粉母細胞減數(shù)分裂過程中，染色體能正常配對形成二價體，經(jīng)過2次分裂后產(chǎn)生四分體，隨后釋放出小孢子。然而在小孢子發(fā)育早期，小孢子發(fā)育緩慢；在中期，細胞質收縮，細胞壁加厚不明顯，出現(xiàn)小孢子粘連；到小孢子發(fā)育晚期，大量小孢子出現(xiàn)粘連降解，或小孢子細胞壁破損，細胞質、細胞核降解消失?！窘Y論】‘新高’梨花粉母細胞的減數(shù)分裂正常，其花粉敗育發(fā)生在小孢子中出現(xiàn)液泡到單核晚期。

關鍵詞：‘新高’梨； 花粉敗育； 減數(shù)分裂； 細胞學

中圖分類號：S661.2 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2012？雪06-1027-04

雜種優(yōu)勢的利用在提高農(nóng)作物產(chǎn)量及抗病、抗逆性等方面發(fā)揮了重要作用。雄性不育系的應用大大地簡化了雜交育種程序，同時也是生產(chǎn)一代雜種最經(jīng)濟、有效的途徑。由于雄性不育系在蔬菜、農(nóng)作物的雜交育種和制種等方面的實用性更強，以及擬南芥等模式植物研究的方便性，所以眾多學者不僅在上述植物中努力尋找、挖掘和創(chuàng)造新的雄性不育資源，而且對其不育性從遺傳學、細胞學、解剖學、生理生化和分子生物學等方面進行了研究[1-2]。在他們的研究中發(fā)現(xiàn)雄性不育系花粉敗育時期和方式多樣，從造孢細胞到二核花粉的各個時期都可發(fā)生，同一品系敗育特征既可出現(xiàn)在一個時期，也可出現(xiàn)在相鄰兩個時期或多個時期。梨作為木本植物，其雄性不育資源沒有像蔬菜等農(nóng)作物在育種和制種方面的實用性，但梨的大多品種自花不結實，雄性不育不能為其他品種提供有效的授粉，這將極大地限制這種品種在生產(chǎn)中的選擇與推廣，因此梨雄性不育機理的研究也受到重視[3-4]。但縱觀前人的研究，主要集中于雄性不育系本身的性狀、花藥組織結構及生理差異的比較[5-7]，而關于梨花粉敗育時期及方式的系統(tǒng)研究國內(nèi)外還未見報道。我們以‘新高’梨為試驗材料，研究花粉母細胞減數(shù)分裂、小孢子發(fā)生及其敗育過程中的細胞形態(tài)特征，為進一步研究其敗育機理提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗以南京溧水新世紀園藝研究所梨品種園內(nèi)長勢一致、花量基本相同的6 a生‘新高’和‘豐水’梨為試材。從3月初開始，結合花藥涂片和45%的醋酸洋紅染色鏡檢，確定花粉發(fā)育的時期，分別在花粉母細胞、四分體、單核花粉期、單核花粉晚期、二核花粉期等發(fā)育時期收集花藥，除一部分直接用作游離小孢子的壓片觀察外，固定于卡諾氏固定液（3倍乙醇∶1倍冰醋酸）中，最長不超過24 h，然后轉移到70%酒精中，放在4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

制片用常規(guī)壓片法觀察花粉母細胞減數(shù)分裂和雄配子體的發(fā)育，染色液分別為石炭酸品紅和醋酸洋紅[8]。Olympus-BX50型顯微鏡下觀察并拍照。

2 結果與分析

2.1 ‘新高’梨花粉母細胞減數(shù)分裂行為的觀察

‘新高’梨花粉母細胞發(fā)育進入減數(shù)分裂前期I之前，細胞體積和細胞核顯著地增大，由于DNA已復制，核的染色逐步加深（圖版Ⅰ-A）。當進入細線期時，細胞核明顯可見（圖版Ⅰ-B）。在偶線期，經(jīng)過同源染色體的配對，纏繞成一團的染色質線逐漸松散（圖版Ⅰ-C）。當絲狀的染色體逐漸縮短變粗時，非姊妹染色單體間發(fā)生了交換，此時已進入粗線期（圖版Ⅰ-D）。終變期時，配對的染色體縮短到最小程度，可以看出17個二價體（圖版Ⅰ-E）。進入中期I后，花粉母細胞里所有二價體均整齊而集中地排列在赤道板上（圖版Ⅰ-F），發(fā)現(xiàn)極少的花粉母細胞里有個別染色體散落在赤道板之外（圖版Ⅰ-G），細胞質里出現(xiàn)紡錘體。此后，同源染色體分離，染色體減半，花粉母細胞染色體均衡地分成兩組并分別向兩極移動。未發(fā)現(xiàn)花粉母細胞染色體出現(xiàn)分離落后的現(xiàn)象，以及染色體分離不同步的特點。進入減數(shù)分裂第一次分裂的后期（圖版Ⅰ-H）。染色體移至兩極后開始消失，松開變細，核膜重新出現(xiàn)，進入末期Ⅰ（圖版Ⅰ-I）。與此同時，形成細胞板，將細胞分隔為二，形成二分體（圖版-J）。第一次減數(shù)分裂后，細胞質并不分裂，而很快進入第二次分裂。中期Ⅱ：染色體各自排列在赤道板上，細胞之間有分裂不同步的現(xiàn)象（圖版Ⅰ-K）。后期Ⅱ、末期Ⅱ：染色單體間順利分離并移向兩極（圖版Ⅰ-L，M），細胞質分裂形成四分體（圖版Ⅰ-N，O），隨后釋放小孢子（圖版-P）。從減數(shù)分裂全過程來看， 除發(fā)現(xiàn)極個別的花粉母細胞在減數(shù)分裂中期I染色體落后外，未發(fā)現(xiàn)‘新高’花粉母細胞減數(shù)分裂的其他異?，F(xiàn)象?！赂摺婊ǚ勰讣毎耐慈旧w能正常聯(lián)會配對，并能正常分離，未發(fā)現(xiàn)小核的形成，細胞質也能正常分離形成四分體，這表明不育系小孢子發(fā)育在減數(shù)分裂期是正常的。

2.2 小孢子發(fā)育的形態(tài)觀察

在對照品種可育的‘豐水’梨花藥中，隨著包圍四分體的胼胝質壁的解體，四分孢子彼此分開，釋放出大小相近的小孢子，即進入小孢子早期。在游離狀態(tài)下，早期小孢子呈現(xiàn)圓球形或橢圓球形，細胞質濃、均勻，細胞核較大、位于細胞的中央，小孢子“壁”隱約可見（圖版Ⅱ-A1，B1）。在小孢子中期小孢子增大，壁顯著加厚，尚未形成中央大液泡。細胞質相對稀少，并貼向細胞的周邊（圖版Ⅱ-C1）。小孢子晚期中央大液泡形成，小孢子核靠近細胞的一邊，細胞核呈圓形，并且體積增大，孢壁增厚（圖版Ⅱ-D1），大體上恢復了圓球形，具有三個孔溝。由于這一時期核的位置及中央大液泡的特點，在一些文獻中，常稱之為“單核靠邊期”。在二核花粉期：單核靠邊小孢子里進行有絲分裂，形成大小不等的生殖細胞與營養(yǎng)細胞，生殖細胞逐漸變成梭形（圖版Ⅱ-E1）。

而在不育的‘新高’梨，四分體剛釋放小孢子中，約10%左右小孢子里出現(xiàn)2個核仁，而且核仁大小存在一定的差異（圖版Ⅱ-F1），而后發(fā)育遲緩。到了單核小孢子中期，小孢子出現(xiàn)細胞質收縮等異?，F(xiàn)象，小孢子壁增厚不明顯，整個小孢子小于可育品種相應時期的小孢子，有些小孢子已開始相互粘連（圖版Ⅱ-G1，H1）。隨著小孢子的進一步發(fā)育，小孢子壁的發(fā)育仍然很差，也未出現(xiàn)三個孔溝（圖版Ⅱ-I1，J1）。雖然有些小孢子的細胞核較完整，并且也移動到靠近壁的一側，但小孢子形狀不規(guī)則且大小不等，且出現(xiàn)細胞質收縮、細胞質解體的跡象（圖版Ⅱ-K1）；大量的小孢子開始出現(xiàn)相互融合降解（圖版Ⅱ-L1）。以后小孢子開始變形，表現(xiàn)為壁凸起，出現(xiàn)許多孔洞，進一步破裂降解（圖版Ⅱ-M1）。與此同時，單核小孢子細胞質稀薄、收縮、解體，由于壁的破裂，細胞質開始外流，加劇了這一過程的的發(fā)生（圖版-N1，O1）。核也緊隨著變形、退化、解體，最后小孢子僅剩少部分降解殘留物（圖版-P1）。

3 討 論

眾多研究表明，由于不同的不育系控制花粉敗育的基因不同，雄性不育系小孢子的敗育時期會因為基因的表達時期以及基因作用機制不同而不同。因此，不同植物種類的雄性不育系的雄性敗育的方式和時期也不相同，甚至同一不育系敗育既可出現(xiàn)在某一時期，也可出現(xiàn)在兩個時期甚至多個時期[9]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)不同植物雄性不育系花粉的敗育方式和時期是多種多樣的，敗育時期從造孢細胞期到二核或三核花粉的各個時期都可發(fā)生。有的發(fā)生在花粉母細胞的減數(shù)分裂期，如擬南芥的兩個突變體msW和 msY在花粉發(fā)育早期發(fā)生異常，減數(shù)分裂不能正常進行[10]。本試驗中‘新高’梨花粉母細胞，除少數(shù)在減數(shù)分裂Ⅰ中期有個別染色體提前解離或散落在赤道板上之外，絕大多數(shù)都能正常進行減數(shù)分裂，并形成四分體，釋放出小孢子。由此可以肯定‘新高’花粉母細胞減數(shù)分裂期是正常的，花粉敗育不在減數(shù)分裂期。目前，關于減數(shù)分裂異常行為與不育性發(fā)生的關系，仍是一個有爭議的問題。有的研究者認為，一般情況下，如果雄蕊減數(shù)分裂異常，雌蕊雖能正常進行減數(shù)分裂，雌蕊也同樣敗育，所以在雌蕊可育的情況下，減數(shù)分裂異常行為偶有發(fā)生，不是不育性發(fā)生的主要原因?！赂摺拇迫锸强捎?，進一步驗證了試驗中所得到的結論。

隨著‘新高’小孢子的發(fā)育，出現(xiàn)了一系列不同于可育品種小孢子發(fā)育的異常特征，表現(xiàn)為小孢子壁發(fā)育遲緩且壁薄，單核小孢子的核退化、解體，細胞質稀薄、收縮、解體，最后細胞壁也破損解體，很少看到有二核小孢子。說明花粉敗育主要發(fā)生在單核小孢子出現(xiàn)液泡到單核晚期。Albbertson等[11]報道玉米GMS突變體ms2和ms7的減數(shù)分裂正常，在四分體時期就出現(xiàn)異常，小孢子細胞壁比正常的小孢子要薄。此后粟翼玟等[12]對秋冬蘿卜雄性不育系64A及其保持系64B小孢子形態(tài)發(fā)生中不同發(fā)育時期的花藥和小孢子的觀察表明，不育系中從四分體初釋放的單核小孢子與正常者無可見差異，當單核小孢子內(nèi)開始出現(xiàn)小液泡時即呈現(xiàn)敗育，胞質淡染，外粉壁薄，整個小孢子停止膨大；隨后其細胞核染色淺或僅見微小核仁?！赂摺媾c上述不育系中小孢子敗育的時期和方式極為相似，說明‘新高’梨和上述材料可能存在相似甚至相同的敗育機制。由于上述不育材料有的作為突變體，有的有相應的保持系，利用現(xiàn)代分子生物學技術和手段，比較容易克隆出控制不育的相關基因，這可能為我們從分子水平揭示‘新高’梨的敗育機制提供了便利和捷徑。

一般認為，花粉壁物質的來源，在四分體時期，只由小孢子的細胞質提供，當小孢子分離以后，壁物質除來自小孢子本身外，還來自絨氈層。說明‘新高’梨小孢子壁發(fā)育不良可能與小孢子和絨氈層都有關?！赂摺鎲魏诵℃咦影|解體，在許多雄性不育系中也都觀察到了這一現(xiàn)象。如韓笑冰等[13]觀察到小麥小孢子敗育時也表現(xiàn)為胞質稀薄解體，認為細胞質中細胞器的結構和功能的改變對小孢子敗育起著重要作用。胡適宜等[14]也曾對不育系單核小孢子的亞微結構觀察，看到小孢子胞質稀薄以及液泡系活動異常。有分析認為小孢子內(nèi)含物的迅速降解很可能與溶酶體的作用有關。至于本試驗中出現(xiàn)的單核小孢子胞質解體是否與液泡等細胞器有關，還需要開展進一步的研究。

綜合上述，‘新高’梨花粉母細胞能夠正常進行減數(shù)分裂，并產(chǎn)生小孢子，小孢子解體發(fā)生在小孢子中出現(xiàn)液泡到單核晚期。（本文圖版見插4，封3）

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