摘要： 【目的】為了探明低溫脅迫對砧木及釀酒葡萄枝條抗寒性的影響，【方法】以甘肅紫軒葡萄酒業(yè)葡萄園中6種砧木及釀酒葡萄品種為試材，分別測定了在不同低溫處理下各品種的電導率、可溶性糖、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）及過氧化氫酶（CAT）的活性?！窘Y(jié)果】結(jié)果表明，6個品種的相對電導率隨著溫度的降低均呈現(xiàn)出顯著遞增趨勢；所有葡萄品種SOD、CAT含量變化均呈先升高后下降的趨勢；與6種葡萄品種抗寒性關(guān)系密切的生理指標為可溶性糖和電導率，通過隸屬函數(shù)法綜合評判得到抗寒性大小依次為‘貝達’>‘雙優(yōu)’+‘貝達’>‘雙紅’+‘貝達’>‘維代爾’>‘赤霞珠’>‘梅鹿輒’。【結(jié)論】研究為釀酒葡萄的引種與栽培管理提供了一定的理論指導。

關(guān)鍵詞： 釀酒葡萄； 低溫脅迫； 抗寒性； 生理指標

中圖分類號：S663.1 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2012？雪06-1040-07

葡萄為落葉藤本植物，是世界最古老的植物之一，喜溫喜光果樹，其生長條件要求高光照及適宜溫度。我國的葡萄產(chǎn)地主要集中在北方地區(qū)，但是北方的嚴寒氣候是制約鮮食葡萄及釀酒葡萄大規(guī)模生產(chǎn)的重要限制因子[1-3]。甘肅紫軒葡萄酒業(yè)葡萄園位于河西走廊中西部，干旱少雨，光照強，熱量適中，空氣干燥，無工業(yè)污染，氣候條件非常適宜釀酒葡萄的種植，已成為我國主要的葡萄生產(chǎn)基地之一，也是中國釀制高品質(zhì)葡萄酒的綠色食品基地，但是冬季的嚴寒氣候給葡萄生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟損失，嚴重制約著該地區(qū)釀酒葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，因此重視并解決該地區(qū)的嚴寒氣候?qū)︶劸破咸焉a(chǎn)的影響和制約，對嘉峪關(guān)市乃至整個北方地區(qū)的葡萄生產(chǎn)有著重要的意義。

目前通過對葡萄抗寒性生理生化指標的測定來進行抗寒性品種篩選已有很多報道，曹建東等[4]以葡萄不同砧木品種為研究對象，隨著處理溫度的降低，各品種的電導率、可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸和丙二醛（MDA）含量逐漸升高，并且各品種升降的速度和幅度有明顯差異，并篩選出電導率以及可溶性蛋白、脯氨酸、MDA含量可以作為葡萄抗寒性評價的鑒定指標。高秀萍等[5]通過對葡萄砧木品種根系抗寒性測定，將其劃分為極度抗寒、抗寒、較抗寒和不抗寒4種，同時對抗根癌病也做了相應(yīng)劃分。牛錦鳳等[1]研究認為在品種抗寒性差異比較大時可用電導率法測定，既簡便又節(jié)省費用，抗寒性差別比較小時則可采用過氧化物酶和可溶性糖測定，若要精細比較抗寒性采用電導率、過氧化物酶、可溶性糖、脯氨酸和MDA的綜合測定。從前人的研究結(jié)果來看，在低溫條件下對不同葡萄品種抗寒性研究大都局限在生理生化指標的測定，而目前并沒有一個統(tǒng)一的標準來對不同葡萄品種抗寒性進行測定及綜合評價。同時前人在對其他生理脅迫，如抗旱性[6-7]、鹽脅迫[8-9]、高溫脅迫[10]及其他作物的抗寒性[11-12]等探討較多，但對于葡萄抗寒性的測定及綜合評價體系方面的研究報道很少，尤其是關(guān)于釀酒葡萄此方面的研究報道相對空白[2，13]。我們針對甘肅省河西戈壁地區(qū)特殊的氣候條件，對該地區(qū)的6種砧木及釀酒葡萄品種進行相關(guān)生理生化指標篩選和綜合評價，以期為該地區(qū)釀酒葡萄生產(chǎn)、種質(zhì)篩選和新品種培育提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況及供試材料

實驗材料取自甘肅紫軒葡萄酒業(yè)釀酒葡萄種植園，該園地處祁連山北麓，位于北緯39°6′，該區(qū)屬典型的大陸性荒漠氣候，年均氣溫8.0 ℃，年極端最高氣溫為38.6 ℃，極端最低氣溫-31.7 ℃，最大凍土深度1.20 m，年均氣溫日較差15.3 ℃，無霜期130 d，年均降水量73.3 mm；太陽總輻射達到560.12～576.84 kJ·cm-2，pH 7.5～8.8[14]；灌溉條件為滴灌，土壤為砂礫土。

供試材料均為3 a生葡萄植株，管理水平一致，栽培樹形采用單株單蔓傾斜式上架，栽植密度為3 m×0.5 m，6個釀酒品種分別為‘雙優(yōu)’嫁接于‘貝達’（‘雙優(yōu)’+‘貝達’）、‘梅鹿輒’、‘貝達’、‘雙紅’嫁接于‘貝達’（‘雙紅’+‘貝達’）、‘赤霞珠’、‘維代爾’。于2011年4月15日（越冬后）每一品種選3～5株，每株剪取40～50 cm長的1 a生枝條1～2枝，立即用聚乙烯膜包裹剪口，放置冰袋中帶回實驗室置于-4 ℃冰箱備用。

1.2 材料處理

將供試材料隨機選取數(shù)枝，剪成10～15 cm的長度，先用流水沖洗，后蒸餾水沖洗數(shù)遍，濾紙擦干放入冰箱進行溫度處理，設(shè)定溫度依次為4 ℃（對照）、0 ℃、-7 ℃、-15 ℃、-20 ℃，處理時間為10 h。將處理后的枝條在室溫下恢復30 min后避開芽眼切成3～5 mm的薄片混勻后稱取適量，測定各指標（3個重復）。

1.3 測定指標及方法

相對電導率參照李合生[15]方法使用DDS-12A型電導儀測定；POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測定[16]；SOD活性采用氮藍四唑（NBT）法測定[16]；CAT活性采用紫外吸收法測定[17]；MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法測定[18]，可溶性糖含量測定采用蒽酮法[19]，脯氨酸含量采用茚三酮比色法測定[16]。

1.4 抗寒性綜合評價

應(yīng)用隸屬函數(shù)法[11，20-21]進行綜合評判。（1）與抗寒性呈正相關(guān)的參數(shù)SOD、脯氨酸、可溶性糖、CAT計算公式： U（Xijk）=（Xijk-Xmin）/（Xmax-Xmin）。（2）與抗寒性呈負相關(guān)的參數(shù)電導率、MDA計算公式： U（Xijk）=1-（Xijk-Xmin）/（Xmax-Xmin）。（1）、（2）中U（Xijk）表示各指標的隸屬度值；Xijk表示表示各指標值測定值；Xmax、Xmin為所有品種第k項指標的最大值和最小值。用各項指標隸屬度的平均值作為樹種抗寒能力綜合評判標準，進行比較。

1.5 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用microsoft office excel 2007和spss 13.0軟件進行統(tǒng)計及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫處理對不同釀酒葡萄品種相對電導率影響

由表1可知，各釀酒葡萄品種在4～-20 ℃溫度依次遞減的條件下，低溫對細胞膜的傷害逐漸增大，細胞膜透性逐漸增加。6個品種的相對電導率均呈現(xiàn)出顯著遞增趨勢，4 ℃最低，-20 ℃最高，且各溫度條件下電導率值差異顯著（P<0.05），在-20 ℃時，各品種間的電導率差異較大，其中‘梅鹿輒’電導率最大（80.9%），‘貝達’電導率最?。?2.24%）。一般選擇相對電導率50%作為植物組織活性的耐性臨界值，超過耐性臨界值的溫度可以作為半致死溫度[22-24]。在高于-7 ℃各品種的相對電導率均小于50%，-7 ℃溫度下‘梅鹿輒’（59.51%）、‘赤霞珠’（63.08%）、‘維代爾’（52.85%）電導率值均超過50%，‘雙優(yōu)’+‘貝達’、‘貝達’、‘雙紅’+‘貝達’的電導率在-15 ℃下分別為54.82%、55.68%、49.27%，說明‘梅鹿輒’、‘赤霞珠’、‘維代爾’的半致死溫度高于-7 ℃，而‘雙優(yōu)’+‘貝達’、‘貝達’、‘雙紅’+‘貝達’的半致死溫度在 -15 ℃左右。同時推測-7 ℃左右是‘梅鹿輒’、‘赤霞珠’、‘維代爾’品種耐受的一個溫度閾值，在此溫度條件下，應(yīng)注意加強這些品種防寒防凍的大田管理。

2.2 低溫處理對不同釀酒葡萄品種POD、SOD活性的影響

由圖1（A）可知，6個品種的POD活性隨著溫度的降低呈現(xiàn)逐步降低的趨勢，‘梅鹿輒’和‘赤霞珠’在4～-20 ℃各溫度條件下，POD活性顯著低于其他品種（P<0.05）；在-7 ℃溫度條件下，‘梅鹿輒’、‘貝達’、‘雙紅’+‘貝達’、‘維代爾’的POD活性較0 ℃降幅較大，分別為78%、53%、40%、53%，推測-7 ℃左右也是幾種葡萄的耐受溫度，可以在低于此溫度下啟動相關(guān)酶對細胞膜的保護措施。

由圖1（B）可知，所有葡萄品種SOD含量變化均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，但是各品種SOD活性到達峰值的溫度及降幅不同，‘梅鹿輒’、‘赤霞珠’、‘維代爾’、‘雙紅’+‘貝達’均在-7 ℃左右時SOD活性達到峰值，在-7 ℃～-20 ℃時SOD活性差異顯著（P<0.05），且較其他品種SOD活性降幅迅速，分別為30%、20%、26%、23%，說明低于-7 ℃葡萄品種的枝條已經(jīng)受到一定程度的損傷，SOD對細胞膜的保護已經(jīng)到達極限，酶系統(tǒng)受到破壞，SOD活性降低?！愡_’和‘雙優(yōu)’+‘貝達’均在0 ℃左右時SOD活性達到峰值，低于0 ℃時SOD活性緩慢降低，推測在這2個品種中SOD的穩(wěn)定性較低。

2.3 低溫處理對不同釀酒葡萄品種CAT活性的影響

如圖1（C）所示，隨著溫度的逐漸降低，6個葡萄品種的CAT含量均呈現(xiàn)先增后降的趨勢，‘梅鹿輒’、‘貝達’、‘雙紅’+‘貝達’、‘赤霞珠’均在-7 ℃時CAT活性達到峰值，分別為90.88、103.58、99.5、96.13，在低于-7 ℃時CAT活性開始降低，其中‘梅鹿輒’降幅最小，推測-7 ℃為一個較為重要的溫度拐點，可能同SOD一樣，低于-7 ℃破壞了相關(guān)保護酶而CAT含量降低?！p優(yōu)’+‘貝達’CAT活性峰值出現(xiàn)在-15 ℃，低于此溫度開始降低，而‘維代爾’在0 ℃時CAT活性已經(jīng)達到了峰值，低于0 ℃時CAT活性開始降低。

2.4 低溫處理對不同釀酒葡萄品種MDA和脯氨酸含量的影響

低溫脅迫下，6種葡萄品種MDA含量變化如圖2（A）所示，隨著溫度的降低，6種葡萄品種的MDA含量均呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，且其余低溫處理均高于對照（4 ℃），在-20 ℃溫度下MDA含量達到最大。其中‘雙優(yōu)’+‘貝達’、‘貝達’、‘雙紅’+‘貝達’的MDA含量較其他品種持續(xù)處于較低水平，且4 ℃～-20 ℃下MDA含量差異不顯著（P>0.05），‘赤霞珠’和‘維代爾’的MDA含量居中，且差異不顯著（P>0.05），而‘梅鹿輒’的MDA含量一直處于較高水平，且顯著高于其他品種。從MDA含量的變化來看，在低溫脅迫下‘梅鹿輒’的細胞膜系統(tǒng)的受損程度最高，膜脂過氧化程度最嚴重，膜透性最大。

在低溫脅迫下，6種釀酒葡萄品種脯氨酸含量變化如圖2（B），反映了脯氨酸含量隨著溫度的降低呈現(xiàn)了持續(xù)升高的特征，說明在逆境條件下，葡萄對低溫脅迫表現(xiàn)出積極的響應(yīng)?？傮w來看，‘雙優(yōu)’+‘貝達’、‘貝達’和‘雙紅’+‘貝達’3個品種脯氨酸含量較高。

2.5 低溫處理對不同釀酒葡萄品種可溶性糖含量的影響

如圖2（C）所示，各品種都隨著處理溫度的降低而呈現(xiàn)出先增高后下降的趨勢，‘梅鹿輒’、‘貝達’、‘雙紅’+‘貝達’、‘維代爾’的可溶性糖含量均在-7 ℃出現(xiàn)峰值，在0 ℃～-7 ℃溫度范圍內(nèi)呈上升趨勢，-7 ℃ ～-15 ℃呈下降趨勢?！p優(yōu)’+‘貝達’和‘赤霞珠’的可溶性糖含量峰值出現(xiàn)在-15 ℃，總體來看，‘貝達’和‘雙紅’+‘貝達’2個品種可溶性糖含量顯著高于其他品種（P<0.05），而‘梅鹿輒’的可溶性糖含量較低。

2.6 應(yīng)用隸屬函數(shù)法對6種釀酒葡萄抗寒性的綜合評價

從表2判定6種釀酒葡萄品種的抗寒性大小依次為‘貝達’>‘雙優(yōu)’+‘貝達’>‘雙紅’+‘貝達’>‘維代爾’>‘赤霞珠’>‘梅鹿輒’。通過本研究可知，電導率和可溶性糖含量與抗寒性關(guān)系密切，可以作為6種砧木及釀酒葡萄抗寒性大小的鑒定指標，其他指標與抗寒性關(guān)系不密切，不宜直接作為6種砧木及釀酒葡萄抗寒性的鑒定指標。

3 討 論

本實驗通過對6種釀酒葡萄相對電導率的測定，結(jié)果顯示，各品種相對電導率隨著脅迫溫度的逐漸降低而增大，這與王燕凌等[25]和肖用森等[26]研究結(jié)果一致。同時大致推測對溫度較為敏感的品種，在-7 ℃左右（電導率超過50%）為其耐性臨界值，如釀酒葡萄‘梅鹿輒’在-7 ℃左右埋土枝條對低溫開始了積極響應(yīng)，而抗寒性強的山葡萄的埋土防寒溫度為-17 ℃左右，因此在嘉峪關(guān)市特殊的地理及氣候條件下進行大田管理時應(yīng)予以重視。本研究在人工模擬低溫脅迫下得到-7 ℃為各指標變化的重要拐點，推測在此溫度下，葡萄枝條內(nèi)各指標對低溫開始一系列復雜的生理響應(yīng)，因此還需結(jié)合自然降溫進一步探討。

可溶性糖和游離脯氨酸是植物體內(nèi)的重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，糖在植物的抗寒生理中，可以提高細胞的滲透濃度，降低水勢，增加植株的保水能力，從而使冰點下降，可以緩和細胞質(zhì)過度脫水，保持細胞不致遇冷凝固，從而提高植物抗寒性[4]。本研究結(jié)果說明葡萄枝條在受到低溫脅迫時，能夠產(chǎn)生較多的糖來保護機體，起到調(diào)節(jié)機體的作用，‘貝達’和‘雙紅’+‘貝達’最高，抗寒性較強，‘梅鹿輒’可溶性糖含量最低，抗寒性最弱，其他品種居中?？扇苄蕴呛颗c抗寒性關(guān)系密切，可以作為6種砧木及釀酒葡萄抗寒性鑒定的生理指標，這與牛錦鳳等[1]對鮮食葡萄抗寒性的研究結(jié)果一致。

低溫環(huán)境使植物體內(nèi)積累脯氨酸，多項研究表明，脯氨酸含量越高，植物的抗寒性越強[27]。在本研究中，脯氨酸含量隨著處理溫度的逐漸降低呈現(xiàn)了持續(xù)升高的特征，但是脯氨酸含量與抗寒性之間不存在相關(guān)關(guān)系，Sanchez 等[28]研究認為，植物體內(nèi)脯氨酸在脅迫響應(yīng)中的角色尚不明確，一般認為是作為滲透活性物質(zhì)發(fā)揮保護作用，其滲透調(diào)節(jié)在豆類植物中作用甚微。因此能否依照脯氨酸大小作為抗寒性的評判指標還有待進一步探討，用綜合評判法進行相互印證非常重要，這也與司劍華等[29]研究結(jié)果一致。

MDA是膜脂過氧化作用的主要產(chǎn)物之一，具有很強的細胞毒性，也是衡量膜系統(tǒng)受害的重要指標之一[11]。經(jīng)過低溫處理后，MDA的含量通常增加，本實驗結(jié)果顯示隨著脅迫溫度的增加，MDA含量均呈逐步上升的趨勢，這也與牛錦鳳等[1]研究結(jié)果一致。

SOD、CAT和POD保護酶的活性也與抗寒性有著密切的關(guān)系。在本試驗中，6種砧木及釀酒葡萄枝條POD含量隨著脅迫溫度的降低而呈現(xiàn)逐步降低的趨勢，但SOD和CAT含量均為先升高后降低，這可能是植物細胞對低溫脅迫的一種保護性應(yīng)急反應(yīng)，故通過低溫鍛煉的誘導可使葡萄細胞內(nèi)防御活性氧的酶促保護系統(tǒng)能力增強，從而維持了細胞膜的穩(wěn)定性，提高了葡萄的耐寒性，但隨著脅迫溫度的進一步降低，超出了品種的耐受范圍使細胞膜受損而呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。

木本植物的抗寒性是由許多數(shù)量或質(zhì)量遺傳基因綜合作用累加的結(jié)果，每一個與抗寒性有關(guān)的性狀對木本植物的抗寒性都起一定的作用，但這種作用是微效的[30]。因此要判斷釀酒葡萄的抗寒性，需要對各抗寒性生理指標進行綜合判斷，而單一的某一個指標具有片面性，通過對各生理指標進行數(shù)量化分析，得到綜合指標的平均隸屬度。本實驗對6種砧木及釀酒葡萄的7項抗寒性生理指標進行隸屬函數(shù)法綜合分析，得出抗寒性大小的次序依次為‘貝達’>‘雙優(yōu)’+‘貝達’>‘雙紅’+‘貝達’>‘維代爾’>‘赤霞珠’>‘梅鹿輒’，同時通過對各項指標的測定結(jié)果分析來看，以上葡萄品種有些是對低溫的滯緩響應(yīng)型品種，如在-15 ℃左右時才達到指標峰值，有些是快速低溫響應(yīng)型品種，如在-7 ℃左右時已達到指標峰值。因此對于園藝工作者來講，掌握各葡萄品種的冬季抗寒能力強弱，并了解其對冬季低溫響應(yīng)的進程，有針對性的加強冬季的防寒管理，對釀酒葡萄在嘉峪關(guān)市的引種與栽培管理工作有實際指導意義。

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