摘要： 【目的】建立刺梨莖尖超低溫保存技術(shù)體系，為刺梨種質(zhì)資源的長(zhǎng)期穩(wěn)定保存提供新途徑?！痉椒ā恳源汤鏋椴牧希芯苛诉m合莖尖超低溫保存的蔗糖預(yù)培養(yǎng)時(shí)間與濃度、預(yù)處理時(shí)間、玻璃化液處理時(shí)間等影響因素?！窘Y(jié)果】適合超低溫保存芽誘導(dǎo)的適宜培養(yǎng)基為MS+0.5 mg·L-1 6-BA+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂。刺梨莖尖玻璃化法超低溫保存體系為：約0.5 cm長(zhǎng)的腋芽莖尖在4 ℃條件下于培養(yǎng)基MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.05 mg·L-1 IAA +0.3 mo1·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂上預(yù)培養(yǎng)3 d，切取約2 mm長(zhǎng)的莖尖，室溫下LS裝載液處理40～50 min，然后用玻璃化液PVS2 于0 ℃下處理40 min，換入新鮮的PVS2，迅速投入液氮中。保存24 h后，在40 ℃水浴中化凍，用MS+1.2 mol·L-1蔗糖+100 mg·L-1 Vc+0.5 mg·L-1 GA3培養(yǎng)基洗滌2次，接種到MS+0.3 mol·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)1 d，再轉(zhuǎn)接到MS+0.1 mg·L-1 6-BA+0.05 mg·L-1 IAA+30 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1瓊脂上暗培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)入正常光下培養(yǎng)，成活率可達(dá)44.3%。【結(jié)論】建立了刺梨莖尖超低溫保存技術(shù)體系。

關(guān)鍵詞： 刺梨； 莖尖； 超低溫保存； 玻璃化法

中圖分類號(hào)：S661.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980？穴2012？雪06-1069-05

2 結(jié)果與分析

2.1 刺梨無(wú)菌材料的建立

2.2 不同濃度6-BA對(duì)刺梨微莖尖培養(yǎng)的影響

2.3 預(yù)培養(yǎng)蔗糖濃度對(duì)超低溫保存結(jié)果的影響

2.4 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)超低溫保存結(jié)果的影響

2.5 裝載液（LS）預(yù)處理時(shí)間對(duì)超低溫保存結(jié)果的影響

裝載預(yù)處理是一個(gè)滲透保護(hù)的處理過(guò)程，可以初步降低組織的含水量，避免由于滲透壓變化太強(qiáng)而對(duì)材料造成傷害[1]。

圖3結(jié)果顯示，LS裝載液預(yù)處理對(duì)超低溫保存效果有明顯的影響。不經(jīng)過(guò)裝載液處理的莖尖幾乎

2.6 玻璃化液（PVS2）處理時(shí)間對(duì)超低溫保存結(jié)果的影響

2.7 解凍后的形態(tài)發(fā)生與植株再生

3 討 論

在植物莖尖超低溫保存研究中，大多以繼代苗的莖尖作為保存材料[1，11-13]，可能是因?yàn)橥ㄟ^(guò)繼代培養(yǎng)可以提高細(xì)胞分裂與分化的同步化頻率，從而提高超低溫保存的存活率。但本研究中，刺梨繼代苗的莖尖長(zhǎng)勢(shì)弱，莖尖不明顯，而采用初代誘導(dǎo)苗的腋芽大、健壯，莖尖明顯，適合作超低溫保存材料，這在葡萄[5]、柿[12]離體莖尖超低溫保存中，也發(fā)現(xiàn)頂芽莖尖保存后不易成活，而腋芽莖尖保存后再生率較高的現(xiàn)象。要使保存后的莖尖能夠成活，莖尖的大小要適當(dāng)。過(guò)大不利于脫水，過(guò)小易造成機(jī)械損傷。因此，在剝?nèi)∏o尖時(shí)，一定要盡量減少機(jī)械損傷，這也是刺梨保存成功的關(guān)鍵。本試驗(yàn)切取刺梨莖尖長(zhǎng)度為2 mm左右，保存效果較好。

一般情況下，在進(jìn)行植物莖尖超低溫保存前，對(duì)材料進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，可以提高超低溫保存后的成活率。用高濃度的蔗糖進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)是較為常用的方法，但本研究先期僅選用高濃度蔗糖進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，保存效果不好，成活率低。而改用高濃度蔗糖結(jié)合低溫（4 ℃）對(duì)刺梨莖尖進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，保存效果較好。預(yù)培養(yǎng)除了要求方法適當(dāng)外，預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間也要適宜。本研究預(yù)培養(yǎng)3 d，保存效果較好，而預(yù)培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短，則成活率都會(huì)降低，這與前人研究結(jié)果一致[9，13]。此外，蔗糖濃度過(guò)高或者預(yù)培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，材料會(huì)出現(xiàn)黃化、水漬化和生活力降低甚至死亡的現(xiàn)象，可能是由于材料脫水過(guò)度、細(xì)胞產(chǎn)生了滲透脅迫所致。

本研究發(fā)現(xiàn)，在恢復(fù)培養(yǎng)時(shí)不進(jìn)行暗培養(yǎng)或暗培養(yǎng)時(shí)間少于7 d，刺梨莖尖幾乎不能成活，因此，恢復(fù)培養(yǎng)初期進(jìn)行一定時(shí)間的暗培養(yǎng)至關(guān)重要。在桃莖尖超低溫保存過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)，化凍后的莖尖通過(guò)15 d的暗培養(yǎng)后，可顯著提高其成活率，若直接在光下培養(yǎng)，成活率極低[13]。在刺梨莖尖恢復(fù)培養(yǎng)初期，進(jìn)行更長(zhǎng)時(shí)間的暗培養(yǎng)是否還可提高其成活率，有待進(jìn)一步研究。

本研究對(duì)刺梨莖尖的超低溫保存取得了重要結(jié)果，但其保存后成活率還比較低，還需對(duì)超低溫保存的程序和方法進(jìn)行優(yōu)化。（本文圖版見(jiàn)插2）

參考文獻(xiàn) References：

[1] FANG Xiu-gui， LI Si-biao. ZHENG Yi-qing. The nutritive value of Rosa roxburghii Tratt and itsdevelopment and utilization[J]. Science and Technology of Food Industry， 2004， 25（1）： 137-138.

方修貴，李嗣彪，鄭益清. 刺梨的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及其開(kāi)發(fā)利用[J]. 食品工業(yè)科技， 2004， 25（1）： 137-138.

[2] NIINO T， TASHIRO K， SUZUKI M， OHUCHI S， MAGOSHI J， AKIHAMA T. Cryopreservation of in vitro grown shoot tips of cherry and sweet cherry by one-step vitrification[J]. Scientia Horticulturae， 1997， 70： 155-163.

[3] WANG Zi-cheng， DENG Xiu-xin. Cyopreservation of citrus shoot-tips by vitrification and regeneration[J]. Acta Horticulturae Sinica， 2001， 28（4）： 301-306.

王子成， 鄧秀新.玻璃化法超低溫保存柑桔莖尖及植株再生[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2001， 28（4）： 301-306.

[4] MATSUMOTO T， MOCHIDA K， ITAMURA H， SAKAI A. Cryopreservation of persimmon （Diospyros kaki Thunb.） by vitrification of dormant shoot tips[J]. Plant Cell Rep， 2001， 20（5）： 398-402.

[5] ZHAO Yan-hua， WU Yong-jie. Study on cryopreservation of in vitro culturedcabemet france shoot tips[J]. Acta Horticulturae Sinica，2001， 28（1）： 62-64.

趙艷華， 吳永杰. ‘品麗珠’葡萄離體莖尖超低溫保存的研究[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2001， 28（1）： 62-64.

[6] AI Peng-fei， LUO Zheng-rong. Cryopreservation of dormant shoot-tips of persimmon by vitrification and plant regeneration[J]. Scientia Agriculturae Sinica， 2003， 36（5）： 553-556.

艾鵬飛，羅正榮. 柿休眠芽莖尖玻璃化法超低溫保存及植株再生[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003， 36（5）： 553-556.

[7] MATSUMOTO T， SAKAI A. Cryopreservation of axillary shoot tips of in vitro-grown grape （Vitis） by a two-step vitrification protocol[J]. Euphytica， 2003， 131（3）： 299-304.

[8] ZENG Ji-wu， YI Gan-jun， ZHANG Qiu-ming. Cryopreservation of in vitro papaya shoot-tips by vitrification technique and its regeneration[J]. Acta Horticulturae Sinica， 2004， 31（1）： 29-33.

曾繼吾，易干軍，張秋明. 番木瓜莖尖的玻璃化法超低溫保存及其植株再生[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2004， 31（1）： 29-33.

[9] XU Xiao-biao，GU Qing-qing，CAI Zu-guo，DENG Xiao-mei， ZHANG Qiu-ming. Cryopreservation of in vitro cultured kiwifruit shoot-tips by vitrification and their regeneration[J]. Scientia Agriculturae Sinica，2006， 33（4）： 842-844.

徐小彪，辜青青，蔡祖國(guó)，鄧小梅，張秋明. 玻璃化法超低溫保存獼猴桃離體莖尖及其植株再生[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2006， 33（4）：842- 844.

[10] TSAI S F， YEH S D， CHAN C F，LIAW S I. High-efficiency vitrification protocols for cryopreservation of in vitro grown shoot tips of transgenic papaya lines[J]. Plant Cell Tiss Organ Cult， 2009， 98（2）：157-164.

[11] ZHAO Yan-hua，WU Ya-qin，CHENG He-he，LI Chun-min，CHEN Xiao-ling，LU Xin-xiong. Cryopreservation of shoot tips from Prunus[J]. Scientia Agriculturae Sinica， 2008， 35（3）： 423 - 426.

趙艷華， 吳雅琴， 程和禾， 李春敏， 陳曉玲， 盧新雄. 李離體莖尖的超低溫保存[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2008， 35（3）： 423-426.

[12] AI Peng-fei， LUO Zheng-rong. Cryopreservation of in vitro shoot-tips of persimmon and date plum by vitrification and genetic stability of regenerated plantlets[J]. Scientia Agricultura Sinica，2004，37（12）： 2023-2027.

艾鵬飛， 羅正榮. 柿和君遷子試管苗莖尖玻璃化法超低溫保存及再生植株遺傳穩(wěn)定性研究[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2004， 37（12）： 2023-2027.

[13] ZHAO Yan-hua， WU Ya-qin. Cryopreservation of shoot tips from peach and its regeneration[J]. Scientia Agriculturae Sinica，2006， 33（5）： 1042-1044.

趙艷華， 吳雅琴. 桃離體莖尖的超低溫保存及植株再生[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2006， 33（5）： 1042-1044.