摘要：【目的】為獲得兼抗2種葡萄病毒的抗病植物新材料，【方法】利用Gateway技術(shù)成功構(gòu)建了葡萄抗病毒雙價RNAi表達載體。先采用RT-PCR分別克隆獲得了葡萄卷葉病毒（GLRaV-3）和扇葉病毒（GFLV）外殼蛋白基因保守區(qū)段，用重疊延伸PCR方法串聯(lián)獲得了干擾片段GLRaV-GFLV（508 bp）；通過TOPO克隆將該片段克隆入載體pENTR/SD/D構(gòu)建了入門克隆載體pENTR/SD/D-GLRaV-GFLV；再經(jīng)過LR反應(yīng)使入門克隆載體pENTR/SD/D-GLRaV-GFLV上的干擾片段GLRaV-GFLV替換目標(biāo)載體pH7GWIWG2（Ⅰ）上的ccdB基因，形成了含2種葡萄病毒基因片段的RNAi 表達載體pH7GWIWG2（Ⅰ）-GLRaV-GFLV，用凍融法將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株EHA105，以此作為工程菌進行轉(zhuǎn)化煙草，【結(jié)果】經(jīng)PCR鑒定證明目的片段已成功轉(zhuǎn)入煙草中?！窘Y(jié)論】研究基于Gateway技術(shù)的RNAi植物表達載體的構(gòu)建和對煙草的遺傳轉(zhuǎn)化，為誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)錄后基因沉默、獲得抗2種病毒病的植物新材料提供了可能。

關(guān)鍵詞： 葡萄； 抗病毒； RNAi植物表達載體； 煙草； 遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號：Ｓ６６3．1 文獻標(biāo)志碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０?穴２０12?雪０6－997－０7

葡萄是世界是最古老的果樹樹種之一，迄今已有5000多年的栽培歷史，因其適應(yīng)強、產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富及具有多種保健功能而深受人們喜愛。近年來，我國葡萄產(chǎn)業(yè)得到迅猛發(fā)展，已成為一些地區(qū)的支柱產(chǎn)業(yè)。病毒病是由植物病毒寄生引起的病害，可通過嫁接、昆蟲和線蟲等途徑傳播，隨著我國地區(qū)間引種的日趨頻繁，加劇了病毒的擴散和傳播，導(dǎo)致一些地區(qū)病害蔓延，病毒復(fù)合侵染的情況也極為普遍，因此，病毒病已逐漸成為制約我國葡萄產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的重要因素之一。目前，我國各大葡萄主產(chǎn)區(qū)病毒病發(fā)生極為普遍，其中以卷葉病毒（Grapevine leafroll virus， 以GLRaV-3為主要致病類型[1]）和扇葉病毒（Grapevine fanleaf virus， GFLV）的發(fā)生最為廣泛[2]，而且2種病毒復(fù)合感染的情況在田間也十分常見，復(fù)合感染后往往會加重病癥并造成葡萄產(chǎn)量和質(zhì)量的嚴(yán)重下降。由于現(xiàn)有技術(shù)水平下尚無有效的防治措施，國際上主要通過推廣無病毒苗木來進行預(yù)防，但我國當(dāng)前相對混雜的苗木市場和分散經(jīng)營的生產(chǎn)實際導(dǎo)致無病毒苗木很難普及，而培育抗病品種無疑是解決這一問題最為經(jīng)濟、有效的途徑。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是真核生物的一種高度保守的和序列特異的RNA降解系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括植物中的轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）、動物中的RNA干擾（RNAi）和真菌中的消除作用（quelling）。作為一種古老的抵抗外來基因（病毒、轉(zhuǎn)座子等）入侵的防御方式，成為基因工程抗病育種中最為有效的一種方法。研究者將構(gòu)建的沉默載體轉(zhuǎn)入植物，通過其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的雙鏈RNA（double stranded RNA，dsRNA）RNA沉默自上世紀(jì)80年代中期以來，利用來自于病毒基因組的部分序列進行植物抗病育種的研究備受關(guān)注，其中以病毒外殼蛋白（Coat Protein， CP）基因的應(yīng)用最為常見[3-4]。目前，利用dsRNA 構(gòu)建RNAi表達載體的報道已有多例[5]，轉(zhuǎn)化植物后誘導(dǎo)發(fā)生的轉(zhuǎn)錄后基因沉默效率最高可達100%[6-7]，可以達到抗病的目的，近年來已成為創(chuàng)制抗病毒轉(zhuǎn)基因作物新種質(zhì)的有效途徑。我們擬構(gòu)建同時包含葡萄卷葉病毒和扇葉病毒外殼蛋白基因保守區(qū)段的雙價RNAi植物表達載體，進一步轉(zhuǎn)化煙草誘發(fā)RNA干擾效應(yīng)，以期培育兼抗2種以上病毒的抗病植物新材料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 感病的葡萄材料為歐洲葡萄品種‘鄭果5號’，取自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所國家葡萄種質(zhì)資源圃。煙草材料為本氏煙（Nicotiana benthaminana）。

1.1.2 酶和試劑 pENTRTM/SD/D-TOPO TOPO Cloning Kit，Gateway LR clonase enzyme mix Kit、反轉(zhuǎn)錄酶購自美國Invitrogen公司，載體pH7GWIWG2（Ⅰ）購自比利時VIB公司，rTaq DNA聚合酶、dNTPs、DNA回收純化試劑盒、PMD18-T克隆試劑盒及各種限制性內(nèi)切酶均為TaKaRa產(chǎn)品，購自大連寶生物工程有限公司，Pfu DNA聚合酶為Fermentas產(chǎn)品，質(zhì)粒小量提取試劑盒購自杭州愛思進生物技術(shù)有限公司，大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞由本實驗室制備并保存。PCR引物均由北京三博遠志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。其他常規(guī)試劑采用進口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 GLRaV-3與GFLV CP基因片段的克隆 采用Trizol法從感病的葡萄材料中提取植物總RNA，根據(jù)文獻已發(fā)表的葡萄卷葉病毒（GLRaV-3，登錄號HQ401017[8]）和扇葉病毒（GFLV登錄號AY780901[9]） CP基因全長序列，分別選擇保守序列區(qū)域設(shè)計合成引物（表1），取2 μg純化后的RNA，在M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶作用下，以隨機引物Oligo dT進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，再以此為模板進行RT-PCR擴增，采用20 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性5 min；（94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s）32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，將目標(biāo)條帶分別用DNA回收純化試劑盒回收，克隆至PMD18-T vector測序，并用BLAST（NCBI）進行序列同源性分析，獲得的2個基因重組質(zhì)粒分別命名為PMD18-GLRaV和PMD18-GFLV。

1.2.2 GLRaV-GFLV串聯(lián)基因片段的獲得 根據(jù)重疊延伸PCR 技術(shù)原理設(shè)計引物，將GLRaV和GFLV 2種葡萄病毒的外殼蛋白基因保守區(qū)段GLRaV-3和GFLV串聯(lián)拼接在一起，以獲得目標(biāo)片段基因GLRaV-GFLV（508 bp）。具體步驟為：（1）分別以GLRaV-F和GLRaV-OVERLAP-R為引物，PMD18-GLRaV質(zhì)粒為模板，和以GFLV-OVERLAP-F和GFLV-R為引物，PMD18-GFLV質(zhì)粒為模板進行PCR反應(yīng)，回收擴增產(chǎn)物，分別命名為GLRaV-OVERLAP和GFLV-OVERLAP。（2）以GLRaV-F和GFLV-R為引物，以純化的GLRaV-OVERLAP和GFLV-OVERLAP為模板進行PCR反應(yīng)，擴增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，回收獲得的串聯(lián)基因片段命名為GLRaV-GFLV，將GLRaV-GFLV連接轉(zhuǎn)入PMD18-T vector，重組質(zhì)粒PMD18-GLRaV-GFLV用EcoRⅠHindⅢ進行雙酶切鑒定，陽性克隆送上海生工測序。

1.2.5 RNAi表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌及鑒定 凍融交替法將pH7GWIWG2（Ⅰ）-GLRaV-GFLV轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，轉(zhuǎn)化細胞均勻涂布于含有壯觀霉素和利福平的YEB固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2 d后，挑單克隆到含有相同濃度的壯觀霉素和利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，28 ℃震蕩培養(yǎng)2 d后，分別用特異引物GLRaV-GFLV-FGLRaV-GFLV-R，以及P35S-FGLRaV-GFLV-R，T35S-F GLRaV-GFLV-R，和潮霉素抗性基因引物Hyg-FHyg-R（目標(biāo)片段565 bp）進行菌液PCR，鑒定陽性克隆。

2 結(jié)果與分析

2.1 GLRaV-3與GFLV CP基因片段的克隆

2.2 GLRaV-GFLV串聯(lián)基因片段的獲得

2.3 入門載體pENTR/SD/D-GLRaV-GFLV的構(gòu)建及其鑒定

2.4 RNAi表達載體pH7GWIWG2（Ⅰ）-GLRaV-GFLV的構(gòu)建及其鑒定

2.5 RNAi表達載體pH7GWIWG2（Ⅰ）-GLRaV-GFLV轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌及其鑒定

2.6 煙草轉(zhuǎn)基因植株的獲得及其PCR檢測

3 討 論

近年來，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)進行植物抗病毒研究已成為植物病理學(xué)家和育種學(xué)家關(guān)注的熱點，利用病毒的外殼蛋白基因防治植物病毒病已有許多成功的例子，如Kamachi等[7]利用黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）的外殼蛋白基因獲得了穩(wěn)定、高效的抗病效果。顏培強等[11]利用TMV的外殼蛋白基因構(gòu)建RNAi 干涉載體并轉(zhuǎn)化至煙草獲得了良好抗性。但是，葡萄病毒在田間復(fù)合侵染的情況也很常見，因此僅構(gòu)建抗某種單一病毒的載體往往不能滿足實際需要。本研究將GLRaV-3 和GFLV 2種葡萄病毒的外殼蛋白基因的保守區(qū)段串聯(lián)在一起，成功構(gòu)建了適合用于植物轉(zhuǎn)化的RNAi雙價表達載體pH7GWIWG2（Ⅰ）-GLRaV-GFLV，并成功轉(zhuǎn)入煙草中，為進一步進行轉(zhuǎn)基因植物的PTGS分析提供了材料。

本研究是通過RNAi轉(zhuǎn)基因創(chuàng)制葡萄抗病新材料的前期工作，主要包括RNAi載體的構(gòu)建和對病原草本寄主煙草的遺傳轉(zhuǎn)化，以及DNA水平上對轉(zhuǎn)基因植株的初步檢測，目前，已獲得了部分抗病的煙草新材料，許多工作還在進行中，如有關(guān)轉(zhuǎn)入植物中外源基因的拷貝數(shù)、dsRNA和siRNA的存在狀況及與獲得抗病性的關(guān)系等，尚待更為深入的研究驗證。（本文圖版見插1）。

參考文獻 References:

[1] CAI Wen-qi， XU Shao-hua， MANG Ke-qiang， MENG Bao-zhong， MA Yun-xia. Purification， serology and detection of grapevine leafroll virus[J]. Acta Microbiologica Sinica， 1997（5）: 385-392.

蔡文啟， 徐紹華， 莽克強， 孟保中， 馬云霞. 葡萄卷葉病毒的純化、血清學(xué)研究及其在脫毒組培苗檢測的應(yīng)用[J]. 微生物學(xué)報，1997（5）: 385-392.

[2] HE Pu-chao. Grape[M]. Beijing: China Agriculture Press， 1999: 394 -398.

賀普超. 葡萄學(xué)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社， 1999: 394-398.

[3] HILY RAVELONANDRO J M， DAMSTEEGT M， BASSETT V， PETRI C，LIU C，SCORZA R. Plum pox virus coat protein gene intron-hairpin-RNA （ihpRNA） constructs provide resistance to plum pox virus in Nicotiana benthamiana and Prunus domestica[J]. Journal of the American Society for Horticultural Sciences， 2007 （132）: 850-858.

[4] LI Qi-ke， TAO Gang， QIU You-bin， QIU Reng， CHI Sheng-qi， ZHU Ying， LIU Zuo-yi. RNAi vector targeting and interference effect determination of PVY CP gene[J]. Genomics and Applied Biology， 2009， 28（3）: 460-464.

李奇科， 陶剛， 邱又彬， 邱礽， 遲勝起， 朱英， 劉作易. 馬鈴薯Y病毒CP基因RNAi載體構(gòu)建與干涉效果測定[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)， 2009， 28（3）: 460-464.

[5] DING Yan-jie， ZHOU Zong-shan， DONG Ya-feng， XU Cheng-nan， WU Yu-xing，CHI Fu-mei. Construction of the RNAi vector of GVA MP gene[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin， 2011， 27（10）: 256-259.

丁艷杰， 周宗山， 董雅鳳， 徐成南， 吳玉星， 遲福梅. 葡萄病毒AMP基因RNA干擾載體的構(gòu)建[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報， 2011， 27（10）: 256 -259.

[6] SMITH N A， SINGH S P， WANG M B， STOUTJESDIJK P A， GREEN A G，WATERHOUSE P M. Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs[J]. Nature， 2000， 407: 319-320.

[7] KAMACHI S， MOCHIZUKI A， NISHIGUCHI M， TABEI Y. Transgenic Nicotiana benthamiana plants resistant to cucumber green mottle mosaic virus based on RNA silencing[J]. Plant Cell Reports， 2007，26 （8）: 1283-1288.

[8] GOUVEIA P， SANTOS M T， EIRAS-DIAS J E， NOLASCO G. Five phylogenetic groups identified in the coat protein gene of grapevine leafroll-associated virus 3 obtained from Portuguese grapevine varieties[J]. Archives of Virology， 2011， 156（3）: 413-420.

[9] VIGNE E， DEMANGEAT G， KOMAR V， FUCHS M. Characterization of a naturally occurring recombinant isolate of Grapevine fanleaf virus[J]. Archives of Virology， 2005， 150（11）: 2241-2255.

[10] HORSH R B. A simple and general method for transferring genes into plants[J]. Science， 1985， 217: 1229-1231.

[11] YAN Pei-qiang， BAI Xian-quan，WAN Xiu-qing， GUO Zhao-kui， LI Li-jie， GONG Hai-ying， CHU Cheng-cai. Expression of TMV coat protein gene RNAi in transgenic tobacco plants confer immunity to tobacco mosaic virus infection[J]. Hereditas， 2007， 29（8）: 1018-1022.

顏培強， 白先權(quán)， 萬秀清， 郭兆奎， 李麗杰， 公海英， 儲成才. 應(yīng)用RNAi 技術(shù)培育抗TMV 病毒轉(zhuǎn)基因煙草[J].遺傳，2007，29（8）: 1018-1022.

[12] MA Jian， WEI Yi-fan， LI Zhi， WANG Pi-wu. Study on the construction method of plant RNAi expression vector[J]. Journal of Anhui Agricultural Science， 2009， 37（18）: 8364-8366.

馬建， 魏益凡，厲志， 王丕武. 植物RNA 干擾表達載體構(gòu)建方法的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2009， 37（18）: 8364-8366.

[13] LIU Ping， XIA Li-qiu， HU Sheng-biao， YAN Li， DING Xue-zhi， ZHANG You-ming， YU Zi-niu. Site-specific integration of heterologous gene into Bacillus thuringiensis chromosome and its expression [J]. Acta Microbiologica Sinica，2008， 48（5）: 661-666.

劉萍， 夏立秋， 胡勝標(biāo)， 嚴(yán)禮， 丁學(xué)知， 張友明， 喻子牛. 外源基因在蘇云金桿菌染色體上的定點整合及表達[J]. 微生物學(xué)報， 2008， 48（5）: 661-666.