摘要: 【目的】 為了初步探討宜昌橙（Citrus ichangensis Swingle）體細(xì)胞染色體聯(lián)會發(fā)生的機制，【方法】以中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院國家種質(zhì)重慶柑橘圃（CRICAAS）提供的宜昌橙為試驗材料，利用熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization， FISH）研究了其體細(xì)胞有絲分裂中期染色體上45S rDNA的分布情況，并結(jié)合聯(lián)會區(qū)域比較分析?！窘Y(jié)果】結(jié)果表明，不同類型宜昌橙細(xì)胞分裂中期染色體45SrDNA的分布位點無明顯差異，均存在4個雜交位點，分別位于第2對同源染色體的短臂端部或者近端部，及第9對染色體的次縊痕區(qū)域。【結(jié)論】宜昌橙體細(xì)胞染色體聯(lián)會現(xiàn)象并非隨機生物現(xiàn)象，而是宜昌橙固有的細(xì)胞學(xué)特征；其體細(xì)胞染色體聯(lián)會以同源染色體聯(lián)會為主，推測可能與異染色質(zhì)集中區(qū)域或者結(jié)構(gòu)形成有關(guān)。

關(guān)鍵詞: 宜昌橙； 體細(xì)胞； 染色體聯(lián)會； 熒光原位雜交； 異染色質(zhì)

中圖分類號：Ｓ６６6．4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０?穴２０12?雪０6－985－０5

宜昌橙為（Citrus ichangensis）為蕓香科（Rutaceae）柑橘屬（Citrus）常綠果樹，具抗寒性強、耐貧瘠、矮化，且具有適應(yīng)性廣和抗病性強（尤其是柑橘潰瘍?。┨攸c，是非常寶貴的柑橘種質(zhì)資源和砧木材料，目前對宜昌橙的研究集中在起源、地理分布、砧木利用以及生理特性方面，而對其細(xì)胞學(xué)研究則相對較少。

染色體在細(xì)胞分裂期配對（chromosome pairing），或者稱聯(lián)會（synapsis）往往是生物體形成配子的減數(shù)分裂特有現(xiàn)象，是減數(shù)分裂的重要特征。Overton[1]和Metz[2]分別于1909和1916年報道了體細(xì)胞染色體聯(lián)會現(xiàn)象。根據(jù)體細(xì)胞有絲分裂中期和間期染色體距離的測量結(jié)果分析，有學(xué)者認(rèn)為某些動物和植物體細(xì)胞中同源染色體位置常常是非隨機的相互靠近，并稱此現(xiàn)象為體細(xì)胞同源染色體配對（somatic pairing），也稱為體細(xì)胞聯(lián)合或者聯(lián)會（somatic association or synapsis）[3]。該領(lǐng)域以往的研究多數(shù)是停留在染色體相互靠近這一表面現(xiàn)象的描述和統(tǒng)計，關(guān)于染色質(zhì)或者染色體絲的真正連接和可能發(fā)生的基因重組和遺傳物質(zhì)的交換以及聯(lián)會的機制方面的研究也只是在少數(shù)物種中有所涉及。

前期研究發(fā)現(xiàn)宜昌橙是體細(xì)胞染色體聯(lián)會很好的材料，不僅可清晰的觀察到染色體質(zhì)或絲之間的連接，且經(jīng)過初步統(tǒng)計，聯(lián)會頻率達(dá)27.1%～40.2%，這為進(jìn)一步深入研究其聯(lián)會發(fā)生的染色體區(qū)域、染色體類型和聯(lián)會機制創(chuàng)造了重要前提條件。我們從細(xì)胞學(xué)角度，利用45S rDNA熒光原位雜交技術(shù)（（fluorescence in situ hybridization， FISH）對宜昌橙體細(xì)胞有絲分裂中期的染色體進(jìn)行觀察和研究，分析了45S rDNA在染色體上的分布位點數(shù)目和分布區(qū)域，初步探討了宜昌橙體細(xì)胞染色體聯(lián)會發(fā)生的機制，為后續(xù)進(jìn)一步的研究提供借鑒和參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.2 45S rDNA-FISH分析 45S rDNA序列質(zhì)粒由南開大學(xué)惠贈，質(zhì)粒DNA提取采用北京鼎國的質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖校瑱z測DNA質(zhì)量用0.8%瓊脂糖凝膠電泳；探針（Roche公司）標(biāo)記使用地高辛隨機引物延伸法；原位雜交及雜交信號的檢測參照Chen等[5]、Jiang等[6]及Kamstra等[7]的方法，稍作改動。主要包括染色體標(biāo)本前處理，探針標(biāo)記，封阻DNA制備，雜交緩沖液配制及雜交，洗脫及信號檢測，鏡檢圖像采集。其中染色體制片襯染試劑為DAPI，所激發(fā)的熒光為藍(lán)色，抗體結(jié)合時均采用Anti-digoxingenin-fluorescein，所激發(fā)的熒光為綠色，為了便于圖片分析，將襯染顏色模擬轉(zhuǎn)換為紅色，因此合成后在信號的區(qū)域則顯示為黃綠色。

2 結(jié)果與分析

3 討 論

3.1 45SrDNA與宜昌橙體細(xì)胞染色體聯(lián)會

通過分析45SrDNA在染色體分布的數(shù)目和定位的位置，可以很好地用于鑒別染色體，同時在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)和物種親緣關(guān)系研究中也是一項很重要的依據(jù)。45SrDNA是高度串接重復(fù)序列，在基因組上有一對或者幾對染色體具有此位點，在染色體上的物理位置具有一定的固定性，可以為研究基因組在分子和染色體水平上的進(jìn)化提供線索[10]，可以有效地反映種、屬間的分化程度[11]。通過FISH技術(shù)將45SrDNA在染色體上進(jìn)行定位，可以為核型分析提供有效的細(xì)胞學(xué)標(biāo)記，特別對于染色體較小且形態(tài)相近的物種[12]，并且對研究基因組間的關(guān)系、進(jìn)化情況以及在基因組內(nèi)區(qū)分染色體類型也具有重要意義[13]。

本文結(jié)合熒光原位雜交技術(shù)研究了宜昌橙體細(xì)胞中期染色體上45SrDNA在宜昌橙體細(xì)胞染色體上的分布區(qū)域和染色體的聯(lián)會進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)它的分布位點主要是第2對同源染色體的短臂端部或者近端部，及第9對染色體的次縊痕區(qū)域。它的分布位點呈現(xiàn)一定的物理位置的固定性。梁國魯?shù)萚9]曾對國家果樹種質(zhì)柑橘圃的60個具有代表性的柑橘屬采用Tanaka的分類系統(tǒng)進(jìn)行分類發(fā)現(xiàn)，宜昌橙的隨體組來自枸櫞的1對縊痕大隨體和柚的1個大隨體。這與梁國魯?shù)萚9]的研究結(jié)果呈現(xiàn)出一致性。

3.2 宜昌橙體細(xì)胞染色體聯(lián)會可能的機制

體細(xì)胞染色體聯(lián)會現(xiàn)象發(fā)生的機制，國內(nèi)外學(xué)者的研究報道中尚未形成定論。有學(xué)者認(rèn)為是化學(xué)藥劑對有絲分裂中期染色體的排列有影響，如秋水仙素，8-羥基喹啉、溴代萘、放線菌酮能增加某些染色體間的距離，而氯霉素則有促進(jìn)體細(xì)胞染色體聯(lián)會的作用。Avivi等[14]發(fā)現(xiàn)秋水仙堿對普通小麥具端著絲粒同源染色體聯(lián)會現(xiàn)象具抑制作用，在預(yù)處理時間相同情況下，著絲粒間的平均距離隨處理液濃度的增加而增加。他們認(rèn)為秋水仙堿破壞了紡錘絲微管蛋白的形成，而抑制同源染色體聯(lián)會。Singh等[15]在證明了小麥——黑麥體細(xì)胞染色體聯(lián)會現(xiàn)象的同時，也認(rèn)為化學(xué)藥物對染色體的預(yù)處理并不影響同源染色體的配對。還有學(xué)者認(rèn)為同源染色體的聯(lián)會現(xiàn)象是一種環(huán)境效應(yīng)，并非生物體固有特性。Ravindran[16]用不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)虎眼萬年青（Ornithogalun virens），發(fā)現(xiàn)根尖細(xì)胞同源染色體的聯(lián)會是些土壤因子后效應(yīng)，pH值則可能使核蛋白的離子發(fā)生變化，導(dǎo)致某些染色體緊密連接。但戴灼華等[17]持相反意見，他發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)金色果蠅近緣種品系腦神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的同源染色體有規(guī)律地聯(lián)會，并認(rèn)為是果蠅物種的固有特性，而非人為或者化學(xué)藥物的作用。

也有學(xué)者認(rèn)為是異染色質(zhì)區(qū)段相互吸引并黏合的結(jié)果。Ashley[18]對O. virens 花粉生殖核及根細(xì)胞染色體的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)C帶技術(shù)處理后，未顯帶的非同源染色體端粒間仍發(fā)生聯(lián)會。有研究表明，染色體聯(lián)會與間期染色中心有關(guān)，而染色中心與中期染色體的結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)一致[19]。所以染色體結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)也可能是促使體細(xì)胞染色體聯(lián)會的一種因素。Avivi等[14]在普通小麥中發(fā)現(xiàn)了影響體細(xì)胞同源染色體聯(lián)會的基因，而在植物減數(shù)分裂中也發(fā)現(xiàn)了一些控制同源染色體聯(lián)會的基因。這就說明不論在有絲分裂還是減數(shù)分裂過程中確實存在基因的調(diào)節(jié)作用，同時也解釋了為什么體細(xì)胞染色體的聯(lián)會現(xiàn)象只在部分物種中發(fā)現(xiàn)，而非廣泛的現(xiàn)象。

從本實驗的結(jié)果顯示出宜昌橙體細(xì)胞染色體聯(lián)會是非隨機的染色體行為，是相對穩(wěn)定而且是以某種特異同源染色體為主，第2對同源染色體的短臂端部或者近端部，及第9對染色體的次縊痕區(qū)域上。通過以上綜合分析，提出宜昌橙體細(xì)胞染色體聯(lián)會現(xiàn)象并非隨機生物現(xiàn)象，而是宜昌橙固有的細(xì)胞學(xué)特征；其體細(xì)胞染色體聯(lián)會以同源染色體聯(lián)會為主，推測可能與異染色質(zhì)集中區(qū)域或者結(jié)構(gòu)形成有關(guān)。后續(xù)的進(jìn)一步開展對宜昌橙體細(xì)胞染色體高級結(jié)構(gòu)和特殊區(qū)域以及異染色質(zhì)功能的研究具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。

參考文獻(xiàn) References:

[1] Overton. On the organization of the nuclei in the pollen mothercells of certain plants，with especial reference to the permanence of the chromosomes[J]. Annals of Botany，1909，23（1）:19-62.

[2] METZ C W. Chromosome studies on the Diptera: Ⅱ. The paired association of chromosomes in the Diptera and its significance[J]. J Exp Zool， 1916，21: 213-279.

[3] XIONG Zhi-ting. The karyotype of Silphium Perfoliatum Linn and its homologous chromosome random arrangement at mistosis metaphase[J]. Hereditas，1989，11（4）: 5-8.

熊治廷.松香草核型及有絲分裂中期同源染色體隨機排列[J]. 遺傳，1989，11（4）: 5-8.

[4] CHEN Rui-yang， SONG Wen-qin， LI Xiu-lan. A new method of making sample of plant mitotic chromosome[J]. Acta Botanica Sinica，1979，21（3）: 297-298.

陳瑞陽，宋文芹，李秀蘭. 植物有絲分裂染色體制片的新方法[J]. 植物學(xué)報， 1979，21（3）: 297-298.

[5] CHEN Q F， ARMSTRONG K. Genomic in situ hybridization in Avena Saliva[J]. Genome，1994， 37: 607-612.

[6] JIANG J M， GILL B S. Sequential chromosome banding and in situ hybridization analysis[J]. Genome， 1993，36: 792-795.

[7] KAMSTRA S A， KUIPERS A G J， DE JEN M J ET Al. The extent and position of homoeologous recombination in a distant hybrid of Alstroemeria: a molecular cytogenetic assessment of first generation backcross progenies[J]. Chromosome，1999， 108: 52-63.

[8] CHEN Rui-yang， AN Zhu-ping， Kenji Taniguchi. Chromosome atlas of Chinese principal economic plants Tomus ⅠChromosome atlas of Chinese fruit trees and their close wild relatives[M]. Beijing:International Academic Publishers，1993: 440-443.

陳瑞陽，安祝平，谷口研至. 中國主要經(jīng)濟植物染色體圖譜第一冊中國果樹及其野生近緣植物染色體圖譜[M]. 北京: 萬國學(xué)術(shù)出版社，1993: 440-443.

[9] LIANG Guo-lu，CHEN Quan-you. Studies on the system and evolution of satellite chromosoms in Citrus[J]. Journal of Southwest Agricultural University，1994，16（2）: 106-110.

梁國魯，陳全友. 柑桔屬隨體染色體系統(tǒng)演化研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1994，16（2）: 106-110.

[10] TAKETA S， HARRISON G E， HESLOP-HARRISON J S. Comparative physical mapping of the 5S and 18S-25S rDNA in nine wild Hordeum Species and cytotypes[J]. Thretical and Applied Genetics， 1999，98: 1-9.

[11] THOMAS H M， HARPER J A， MORGAN W G. Gross chromosome rearrangements are occurring in an accession of the grass Lolium rigidum[J]. Chromosome Research，2001， 9: 585-590.

[12] PEDROSA A， GUERRA M， SOARES FILHO W DOS S. A hierarchy of activation of nucleolar organizer regions in Citrus sinensis （L.）[J] .Osbeck Cytobios， 1997， 92: 43-51.

[13] LIU Bo， CHEN Cheng-bin， LI Xiu-lan， QI Li-wang， HAN Su-ying. Karyotype analysis and physical mapping of 45S rDNA in eight species of Sophora， Robinia and Amorpha[J]. Acta Botanica Yunnanica， 2005 ，27（3）:261-268.

劉博，陳成彬，李秀蘭，齊力旺，韓素英. 豆科三屬八種植物的核型及rDNA定位研究[J]. 云南植物研究，2005，27（3）: 261-268.

[14] AVIVI L， FELDMAN M， BUSHUK W. The mechanism of somatic association in common wheat， Triticum aestivum L.Ⅰ. Suppression of somatic association by colchicine[J]. Genetics，1969，62: 745-752.

[15] SINGH R J，ROBBELEN G，OKAMOTO M． Somatic association at interphase studied by Giemsa banging technique[J]. Chromosome （Brel），1976，56: 265-273．

[16] RAVINDRON P N. Homologous association in somatic cells of Ornithogalum virens[J]. Cytologia，1977，42: 1-4.

[17] DAI Zhuo-hua，DIAO Fu-shan. The studies of chromosomes in Drosophila auraria comples species found in China and Japan Ⅱthe synapsis of homologous chromosomes in mitosis of Drosophila auraria complex species found in China and Japan[J]. Acta Genetica Sinica，1987，14（6）: 447-454.

戴灼華，刁福山. 中國金色果蠅復(fù)合種的染色體研究Ⅱ中國及日本金色果蠅復(fù)合種的體細(xì)胞同源染色體聯(lián)會[J].遺傳學(xué)報，1987，14（6）: 447-454.

[18] ASHLEY T. Specific end-to-end attachment of chromosome in Ornithogalum virens[J]. J Cell Sci， 1979， 38: 357-367.

[19] GODIN D E，STACK S M. Homologous and nonhomologous chromosome associations by interchromosoal chromatin connectives in Ornithogalum virens[J]. Chromosoma. 1976，57（4）: 309-318.