摘要： 【目的】為了探討桃果實(shí)中類胡蘿卜素含量的測(cè)定方法，分析桃果實(shí)中類胡蘿卜素的主要成分及其含量，【方法】以桃品種‘獨(dú)立’成熟果實(shí)為試驗(yàn)材料，采用紫外分光光度計(jì)法和高效液相色譜法對(duì)不同提取劑、提取方法、色譜柱進(jìn)行分析比較，篩選出適宜進(jìn)行桃果實(shí)類胡蘿卜素定性定量分析的方法。【結(jié)果】結(jié)果表明，桃果實(shí)類胡蘿卜素的最佳測(cè)定方法是以丙酮為有機(jī)提取劑，不經(jīng)過(guò)皂化直接提取，經(jīng)過(guò)0.22 mm有機(jī)濾頭過(guò)濾，采用YMC-C30色譜柱進(jìn)行測(cè)定，流動(dòng)相A： 甲醇，流動(dòng)相B： 甲基叔丁基醚，流動(dòng)相C： 水；流速： 1.0 mL·min-1；UV 450 nm；溫度為25 ℃；時(shí)間： 100 min；進(jìn)樣： 20 μL；梯度沖洗： 0～90 min，81%A/15%B/4%C～6%A/90%B/4%C；92 min，81%A/15%B/4%C。【結(jié)論】提取和高效液相色譜檢測(cè)方法可對(duì)桃果實(shí)類胡蘿卜素進(jìn)行定性定量分析。

關(guān)鍵詞： 桃； 類胡蘿卜素； 組分； 高效液相色譜

桃是世界上重要的落葉果樹之一，我國(guó)桃樹栽培歷史悠久，資源豐富，是桃的起源中心。1990年Morrison[1]報(bào)道認(rèn)為100 g果肉為黃色的果實(shí)中含289 mg β-胡蘿卜素，100 g果肉為橙黃色的果實(shí)中含445 mg β-胡蘿卜素，而白肉桃果肉內(nèi)不含β-胡蘿卜素。充分成熟的桃果實(shí)中主要呈色色素是類胡蘿卜素，其含量及組成影響黃桃和紅肉桃果實(shí)的色澤，繼而影響品質(zhì)和商品價(jià)值。類胡蘿卜素為脂溶性的天然色素，除了在植物光合系統(tǒng)中不可或缺，對(duì)人體也有不可替代的作用。目前在柑橘、枇杷、枸杞、杧果、沙棘等研究較多。

類胡蘿卜素的檢測(cè)方法主要有分光光度法、薄層色譜法、高效液相色譜法。分光光度法能用于測(cè)定純類胡蘿卜素的量或濃度，或用來(lái)估算混合物或天然萃取物中的總類胡蘿卜素含量，但精確度相對(duì)較低。崔麗娜等[2-6]對(duì)玉米籽粒、番木瓜、胡蘿卜渣干燥過(guò)程、銀杏葉片、沙棘油的研究以及許建蘭等[7]等對(duì)類胡蘿卜素含量的測(cè)定采用均采用分光光度法。薄層色譜法具有操作簡(jiǎn)便、快速等特點(diǎn)，比較多的用于定性分析。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)樣品： 黃肉桃‘獨(dú)立’（Prunus persica‘Indenpendence’）。于2011年7月中旬，采自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院國(guó)家果樹種質(zhì)桃資源圃。采收成熟果實(shí)10個(gè)，取混合果肉約10 g，于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

儀器： 紫外-可見分光光度計(jì)；高效液相色譜儀；冷凍離心機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 類胡蘿卜素的提取 稱取2 g左右的混合新鮮果肉，液氮研磨，加入8 mL的有機(jī)溶劑，4 ℃冰箱避光浸提。浸提后于離心機(jī)4 ℃ 10 000 g離心5 min，重復(fù)操作直至殘?jiān)鼮闊o(wú)色，合并浸提劑，定容至25 mL，過(guò)0.22 mm有機(jī)濾頭，備用。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.2 有機(jī)溶劑的確定 采用不同的有機(jī)提取劑及配比，提取步驟同1.2.1。有機(jī)提取劑分別為甲醇、丙酮、正己烷、石油醚、乙酸乙酯、丙酮石油醚（1∶1）、丙酮正己烷（3∶2）、丙酮乙酸乙酯（3∶2）。

1.2.3 提取方法的確定 采用3種不同的提取方法提取類胡蘿卜素。

方法一： 直接用丙酮提取后定容測(cè)定；

方法二： 丙酮提取后經(jīng)40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干后，用4 mL乙酸乙酯溶解測(cè)定；

方法三： 丙酮提取后經(jīng)40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，用4 mL的石油醚溶解，加入4 mL 10%KOH-甲醇溶液，皂化過(guò)夜，加入10%NaCl分層萃取，下層水相用石油醚萃取2次，合并石油醚相，于40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，用4 mL乙酸乙酯溶解后測(cè)定。

1.2.4 混合標(biāo)樣的制備 以10 mg·L-1的混合標(biāo)樣溶液為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，制備系列質(zhì)量濃度為0.005、0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1.0、5.0 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，過(guò)0.22 mm有機(jī)濾頭，備用。

1.2.5 類胡蘿卜素的測(cè)定 利用UV755B型紫外-可見分光光度計(jì)，以丙酮溶液為空白，在波長(zhǎng)300～700 nm掃描，確定最佳吸收波長(zhǎng)，并測(cè)定獨(dú)立果實(shí)類胡蘿卜素的總含量；采用Agilent1100 series高效液相色譜儀進(jìn)行梯度沖洗，測(cè)定類胡蘿卜素的各組分和含量。

2.1 最佳類胡蘿卜素提取條件的篩選

2.1.1 不同有機(jī)溶劑提取效果的比較 不同種類和組合的有機(jī)溶劑提取類胡蘿卜素的效率有一定的差異。按1.2.1方法提取后測(cè)定，結(jié)果表明， 8個(gè)有機(jī)溶劑對(duì)果實(shí)類胡蘿卜素的提取都有一定的影響，其中以丙酮提取的含量最多；如圖1所示。通過(guò)SPSS12.0軟件分析，丙酮的提取效果與其余的7個(gè)有機(jī)溶劑間存在極顯著差異，因此確定丙酮為桃果實(shí)類胡蘿卜素提取的有效有機(jī)溶劑。

2.1.2 不同提取方法對(duì)桃果實(shí)類胡蘿卜素提取的影響 在類胡蘿卜素的提取過(guò)程中，皂化過(guò)程至關(guān)重要。但在皂化過(guò)程中類胡蘿卜素總量或單個(gè)類胡蘿卜素都有降解損失，這種損失取決于皂化的條件和樣品的成分。本試驗(yàn)以單純丙酮提取的效果明顯好于單經(jīng)過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)處理和經(jīng)過(guò)皂化處理的，如圖2所示。通過(guò)SPSS12.0軟件分析，單純丙酮提取的結(jié)果與單經(jīng)過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)處理和經(jīng)過(guò)皂化處理的之間存在極顯著差異，后2者之間無(wú)顯著性差異。因此，以單純丙酮的提取而不經(jīng)過(guò)皂化處理的方法為桃果實(shí)類胡蘿卜素提取的最佳方法。

2.2 最佳吸收波長(zhǎng)的確定

2.3 不同色譜柱及流動(dòng)相對(duì)桃果實(shí)類胡蘿卜素提取的影響

同時(shí)，在選定采用YMC-C30色譜柱測(cè)定后，將流動(dòng)相改變，由MeOH、MTBE和H2O按比例配成的流動(dòng)相A： MeOH∶MTBE∶H2O=81∶15∶4和B： MeOH∶MTBE∶H2O=6∶90∶4，改成不經(jīng)混合配比的3個(gè)純流動(dòng)相A： MeOH、B： MTBE、C： H2O。結(jié)果表明不同流動(dòng)相測(cè)定類胡蘿卜素標(biāo)樣都能很好的將5個(gè)標(biāo)樣分離，流動(dòng)相改后的出峰時(shí)間往后推遲，出峰間隔較大，更有利于將各個(gè)成分區(qū)分開來(lái)（圖5）。而在樣品的測(cè)定過(guò)程中，流動(dòng)相改前測(cè)定‘獨(dú)立’果實(shí)的類胡蘿卜素，出峰時(shí)間發(fā)生了飄移。在測(cè)定過(guò)程中，對(duì)出峰時(shí)間的確定難度大，準(zhǔn)確度大大降低（圖6）。而流動(dòng)相改為流動(dòng)相A、B、C 3項(xiàng)分別為甲醇、甲基叔丁基醚、水后，如圖7所示，混標(biāo)中，各個(gè)標(biāo)樣的出峰時(shí)間明確，容易區(qū)分，標(biāo)樣和樣品的出峰時(shí)間一致，說(shuō)明此方法可用來(lái)對(duì)桃果實(shí)類胡蘿卜素進(jìn)行定性定量分析。

2.4 獨(dú)立果實(shí)類胡蘿卜素成分及其含量的測(cè)定

2.4.1 類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 以0.005、0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1.0、5.0 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線公式如表1所示。

蔬菜、水果中的類胡蘿卜素主要以脂肪酸酯的形式存在，其酯化程度依葉黃素中羥基數(shù)目的多少而變化。為簡(jiǎn)化其分離，用于類胡蘿卜素定量分析的許多方法首先都要對(duì)提取液進(jìn)行皂化處理。在皂化過(guò)程中類胡蘿卜素總量或單個(gè)類胡蘿卜素都有降解損失，這種損失取決于皂化的條件和樣品的成分。近幾年，出現(xiàn)了許多同時(shí)測(cè)定水果中游離類胡蘿卜素和酯化類胡蘿卜素的色譜方法，從而免去了皂化步驟。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果是桃果實(shí)類胡蘿卜素的提取不經(jīng)過(guò)皂化而直接采用丙酮提取的效果最佳，后兩種方法可能是在提取過(guò)程中，皂化、濃縮等步驟，影響了類胡蘿卜素的提取，降低了提取量。也說(shuō)明了皂化過(guò)程會(huì)使類胡蘿卜素總量下降。

本試驗(yàn)采用ZORBAX.SB-C18和YMC-C30兩種色譜柱，采用YMC-C30色譜柱檢測(cè)桃果實(shí)類胡蘿卜素的分離效果較好，與盧紅梅等[13]的研究結(jié)果一致。YMC-C30色譜柱可在相同流動(dòng)相條件下分離順式、反式β-胡蘿卜素以及黃體素和玉米黃體素在紅的極性葉黃素異構(gòu)體，可分辨極性和非極性的胡蘿卜幾何構(gòu)體。與傳統(tǒng)的C18柱相比，用這種新的固定相來(lái)分離類胡蘿卜素異構(gòu)體顯示出優(yōu)越的分離度[13]。采用C30柱，以甲醇-甲基叔丁基醚（MTBE）-水為流動(dòng)相，采用梯度洗脫，實(shí)現(xiàn)了單層硅烷和多層硅烷C18柱在這個(gè)流動(dòng)相體系中無(wú)法實(shí)現(xiàn)的β-胡蘿卜素的4種異構(gòu)體的分離。

試驗(yàn)過(guò)程中，樣品測(cè)定后不能繼而測(cè)定第二個(gè)樣品的原因在于： 本實(shí)驗(yàn)是采用梯度沖洗，當(dāng)完成一個(gè)樣品的測(cè)定后，機(jī)器沒有回到原初檢測(cè)的平衡狀態(tài)，導(dǎo)致出峰時(shí)間的重疊、堆積，無(wú)法科學(xué)、真實(shí)地檢測(cè)出樣品中類胡蘿卜素的成分及其含量。為了使實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蝽樌M(jìn)行，要讓機(jī)器重新回到平衡狀態(tài)，即測(cè)定時(shí)間由原來(lái)的90 min延長(zhǎng)至100 min，機(jī)器可在這10 min內(nèi)重新回到平衡狀態(tài)，繼而進(jìn)入下一個(gè)樣品的測(cè)定。但真正影響出峰時(shí)間的是流動(dòng)相的濃度。流動(dòng)相中，由于甲基叔丁基醚和水互不相容，配制難以避免較大的濃度誤差，且配制一段時(shí)間后，流動(dòng)相B（MeOH∶MTBE∶H2O=6∶90∶4）中會(huì)有分層的現(xiàn)象，這嚴(yán)重影響檢測(cè)時(shí)流動(dòng)相的濃度，從而影響出峰時(shí)間，即出峰飄移。影響高效液相色譜法測(cè)定桃果實(shí)類胡蘿卜素的環(huán)境因素還有檢測(cè)時(shí)的溫度，溫度30 ℃太高，測(cè)定過(guò)程中出現(xiàn)較多的雜峰，很難分辨出被測(cè)成分。當(dāng)溫度改為25 ℃時(shí)，樣品測(cè)定過(guò)程中，出現(xiàn)的均是被測(cè)成分的峰值。這說(shuō)明溫度是影響高效液相色譜法測(cè)定桃果實(shí)類胡蘿卜素不可忽視的重要因素。

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