摘要：【目的】為探求綠色木霉菌發(fā)酵液對杧果炭疽菌的抑制機制，【方法】以杧果炭疽菌為供試菌，研究綠色木霉菌及其發(fā)酵液對杧果炭疽菌菌絲生長、孢子萌發(fā)、無機磷的吸收、細胞通透性的影響?！窘Y(jié)果】綠色木霉菌發(fā)酵液處理后杧果炭疽菌菌絲嚴重枯萎變形；處理24 h，孢子萌發(fā)率比對照組低86.40%；無機磷吸收基本停止；核酸、蛋白質(zhì)等大分子滲漏嚴重；杧果炭疽菌胞內(nèi)可溶性蛋白及還原糖含量明顯少于對照組?！窘Y(jié)論】綠色木霉菌發(fā)酵液能夠破壞杧果炭疽菌細胞的完整性，抑制杧果炭疽菌生長。

關(guān)鍵詞： 綠色木霉菌； 發(fā)酵液； 杧果炭疽菌； 生長抑制； 細胞損傷

中圖分類號：S661.1 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2012？雪06-1097-06

杧果炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz）是杧果果實采前及采后的主要病原真菌，具潛伏侵染性，可引起貯藏期間的杧果30%～50%腐爛。中國、美國、印度、巴西、菲律賓、泰國、印度尼西亞、剛果等國均有報道。人們已經(jīng)研究了肉桂[1]、石菖蒲[2]、香根草[3]等提取揮發(fā)油對炭疽菌的菌絲生長、孢子萌發(fā)的抑制作用[4]，以及溫度、濕度[5]、光照[6]等環(huán)境因素對孢子萌發(fā)的影響，但植物提取物成本高，原材料受生長季節(jié)和地域的限制，難以在杧果采后保鮮處理的生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。利用拮抗微生物定向發(fā)酵技術(shù)，生產(chǎn)抑菌防腐物質(zhì)，發(fā)酵條件和工藝皆可控制，為實現(xiàn)低成本的連續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)提供了可能性，這是天然果蔬防腐保鮮劑的重要研究方向。

木霉菌（Trichoderma）是一類自然界普遍存在的真菌。其中，綠色木霉菌（T. viride）、哈茨木霉菌（T. harzianum）、康氏木霉菌（T. koningii）、鉤狀木霉菌（T. hamatum）和長枝木霉菌（T. longibrachiatum）等對農(nóng)作物田間真菌病害具拮抗作用[7-9]。綠色木霉菌具有適應(yīng)性強，繁殖速度快、對植物病原真菌具廣譜拮抗作用等優(yōu)點，已成為人們研究的熱點[10-11]。國內(nèi)外對綠色木霉菌生物防治作用的拮抗機制，農(nóng)作物病害防治應(yīng)用進行了研究[12-14]，但未見綠色木霉菌發(fā)酵液對杧果炭疽菌菌絲生長的抑制及細胞損傷的報道。本試驗研究綠色木霉菌發(fā)酵液對杧果炭疽菌菌絲生長的抑制作用，以及對其細胞完整性的影響，以期探求抑菌作用機制，為綠色木霉菌發(fā)酵液用于杧果采后保鮮處理提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

綠色木霉菌 （T. viride），購于廣東省微生物研究所；杧果炭疽菌（C. gloeosporioides Penz），華南農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 T. viride發(fā)酵液的制備 參照蔣雨[15]方法，200.0 g馬鈴薯，10.0 g玉米粉，20.0 g葡萄糖，1.0 g吐溫-80，1.0 L水。T. viride經(jīng)活化，制成106 CFU·mL-1孢子懸液，250 mL錐形瓶中加50 mL培養(yǎng)基，接種量1.0%（v/v），于32.5 ℃，125 r·min-1，培養(yǎng)7 d。發(fā)酵液經(jīng)孔徑0.22 μm濾膜過濾，除去孢子，50 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1/25體積，得樣液，4 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 T. viride對C. gloeosporioides的抑制作用

參照黃雪蓮[16]方法，采用一點對峙培養(yǎng)法。分別在新培養(yǎng)好的綠色木霉菌和杧果炭疽菌菌落上，取生長能力一致的同心圓處切取直徑為5 mm的菌餅，接種到PDA平板中，兩接種點相距50 mm，以只接種杧果炭疽菌為對照，30 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，觀察，拍照。

1.2.3 T. viride發(fā)酵液對C. gloeosporioides生長的影響 參照方中達[17]方法，采用載片培養(yǎng)法，在90 mm培養(yǎng)皿中倒上薄薄一層含T. viride發(fā)酵液的PDA培養(yǎng)基，凝固后用滅菌的手術(shù)刀切取20 mm×30 mm薄片，置于無菌載玻片中央，挑取C. gloeosporioides菌絲接種于小方塊兩邊平行的中點，蓋蓋玻片，放入培養(yǎng)皿內(nèi)下層墊有濕潤濾紙的玻棒上，以無T. viride發(fā)酵液的PDA培養(yǎng)基為對照，30 ℃恒溫保濕培養(yǎng)，逐日觀察。拍攝（OLYMPU S BX63光學(xué)顯微鏡，日本OLYMPUS公司）。

1.2.4 T. viride發(fā)酵液對C. gloeosporioides孢子萌發(fā)的影響 參照陶金華等[18]的方法， T. viride發(fā)酵液與C. gloeosporioides孢子懸液各1.0 mL置于試管中，加棉塞，搖勻，30°傾斜放置。以等體積無菌培養(yǎng)基與C. gloeosporioides孢子懸液混勻為對照，30 ℃培養(yǎng)，于6.0、12.0、18.0、24.0、30.0 h取20 μL于載玻片，顯微測量100個孢子的萌發(fā)情況，統(tǒng)計孢子萌發(fā)狀況（以芽管長度超過孢子短直徑的一半作為萌發(fā)標準）。

孢子萌發(fā)率（%）=孢子萌發(fā)數(shù)/總孢子數(shù)×100

1.2.5 T. viride發(fā)酵液對C. gloeosporioides磷吸收的影響 參照翟培等[19]的方法，將活化后的C. gloeosporioides轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)72 h，離心（3 000 r·min-1，5 min），沉淀用0.1 mol·L-1 pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液稀釋成106 CFU·mL-1菌液。取0.5 mL菌液和0.5 mL葡萄糖溶液（1.0 g·L-1）于離心管內(nèi)，加200 μL 0.026 mol·L-1磷標準液和200 μL T. viride發(fā)酵液，在0.0、3.0、6.0、12.0、18.0、24.0、30.0 h取樣0.1 mL，加入0.6 mol·L-1 三氯乙酸、硫酸亞鐵-鉬酸銨試劑，于660 nm比色（DU730紫外及可見分光光度計，美國Beckman coulter Inc）測總磷含量。等體積無菌水為對照。

1.2.6 T. viride發(fā)酵液對C. gloeosporioides細胞核酸、蛋白泄漏的影響 參照Latoud等[20-21]的方法，C. gloeosporioides孢子于PDA液體培養(yǎng)基中，25℃，125 r·min-1搖床培養(yǎng)30 h，6 000 r·min-1離心15 min，收集菌絲體，在0.01 mol·L-1 pH 6.8檸檬酸-磷酸鹽緩沖液中重懸浮。加T. viride發(fā)酵液樣液，使終濃度達MIC50濃度值。對照組加等體積檸檬酸-磷酸鹽緩沖液。培養(yǎng)0.0、6.0、12.0、18.0、24.0、30.0、36.0 h取樣，離心除菌體，取上清液于260 nm和280 nm處測吸光度。

1.2.7 T.viride發(fā)酵液對C. gloeosporioides胞內(nèi)可溶性蛋白含量的影響 參照石志琦等[22]、張龍翔等[23]的方法，將C. gloeosporioides接種于PDA培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)4 d，刮孢子于液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)72 h。加T. viride發(fā)酵液樣液，使終濃度達MIC50濃度值，對照添加等體積無菌水。0.0、6.0、12.0、18.0、24.0、30.0、36.0 h抽濾得菌絲體，去離子水反復(fù)沖洗，稱重0.4 g，加2.0 mL 0.025 mol·L-1 Tris-HCl（pH 7.5），冰浴研磨，4 ℃，12 000 r·min-1離心15 min，取上清液0.1 mL，稀釋10倍，取稀釋液0.1 mL，加3.0 mL考馬斯亮藍G-250，靜置5 min，于595 nm處測吸光度。

1.2.8 T. viride發(fā)酵液對C. gloeosporioides胞內(nèi)還原糖含量的影響 參照石志琦等[22]、張龍翔等[23]的方法，將菌株接種于PDA培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)4 d，刮孢子于液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)72.0 h。加T. viride發(fā)酵液樣液，使終濃度達MIC50濃度值，對照添加等體積無菌水。0.0、6.0、12.0、18.0、24.0 h、30.0、36.0 h抽濾得菌絲體，去離子水反復(fù)沖洗，稱重0.4 g，加2 mL 0.025 mol·L-1 Tris-HCl（pH7.5），冰浴研磨，4 ℃，12 000 r·min-1離心15 min，取上清液0.1 mL，加2.0 mLDNS，沸水浴5 min，冷卻后蒸餾水定容至25 mL，于540 nm處測吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以上每試驗重復(fù)3次。Excel 2012處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 T. viride對C. gloeosporioides抑制效果

對峙培養(yǎng)試驗表明：T. viride可有效抑制C. gloeosporioides生長（圖版-A，B）。第3天，T. viride的生長速度明顯快于C. gloeosporioides。3 d后T. viride將C. gloeosporioides菌落包圍，且出現(xiàn)抑菌帶。

2.2 T. viride發(fā)酵液對C. gloeosporioides菌絲生長的影響

與對照組（圖版-C）相比，T. viride發(fā)酵液可顯著抑制C. gloeosporioides菌絲的生長（圖版-D）。經(jīng)發(fā)酵液處理后C. gloeosporioides菌絲數(shù)量減少、直徑變細、長度變短，出現(xiàn)褶皺、空腔、嚴重變形等現(xiàn)象（圖版-E～G）。推測T. viride發(fā)酵液可能損傷了C. gloeosporioides細胞壁以及細胞膜結(jié)構(gòu)，進而達到抑菌甚至殺菌的作用。

2.3 T. viride發(fā)酵液對C. gloeosporioides孢子萌發(fā)的影響

T. viride發(fā)酵液可有效抑制C. gloeosporioides孢子萌發(fā)（圖1）。試驗期間，未經(jīng)發(fā)酵液處理的C. gloeosporioides孢子萌發(fā)率快速上升，經(jīng)30 h培養(yǎng)，孢子萌發(fā)率達100%。發(fā)酵液處理組培養(yǎng)30 h，C. gloeosporioides孢子萌發(fā)率僅為12.53%，比對照組低87.47百分點。表明T. viride發(fā)酵液可極顯著抑制C. gloeosporioides孢子的萌發(fā)（P<0.01）。

2.4 T. viride發(fā)酵液對C. gloeosporioides 磷吸收的影響

微生物對磷的吸收量可反映其生長狀態(tài)。T. viride 發(fā)酵液處理C. gloeosporioides 0.0～3.0 h，培養(yǎng)基中磷的消耗量與對照組差異不大；在3.0～24.0 h，對照組培養(yǎng)基中總磷含量減少了1.6 mg·L-1，處理組培養(yǎng)基中磷含量無明顯變化，C. gloeosporioides 對磷的吸收已經(jīng)趨于停止。這表明 T. viride 發(fā)酵液可嚴重阻礙 C. gloeosporioides 對環(huán)境中磷的吸收，進而抑制 C. gloeosporioides 生長（圖2）。

2.5 T. viride發(fā)酵液對C. gloeosporioides細胞核酸、蛋白質(zhì)滲漏的影響

測定培養(yǎng)基A260 nm、A280 nm，即可知其中核酸、蛋白質(zhì)含量，它反映微生物細胞透性的變化。由圖3知，T. viride發(fā)酵液處理組在0.0～30.0 h內(nèi)，A260nm、A280nm分別由0.007、0.005上升至0.173、0.047，培養(yǎng)基中核酸、蛋白質(zhì)含量逐漸增加，增幅高于對照組73.40%、 36.17%。表明發(fā)酵液處理可改變C. gloeosporioides 細胞膜透性，導(dǎo)致胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)滲漏，進而抑制其生長。

2.6 T. viride發(fā)酵液對C. gloeosporioides胞內(nèi)可溶性蛋白、還原糖的影響

由圖4知，試驗期間，對照組C. gloeosporioides菌體可溶性蛋白含量大幅度增加，而T. viride發(fā)酵液處理組的C. gloeosporioides菌體可溶性蛋白含量呈緩慢上升趨勢。發(fā)酵液處理組36.0 h吸光度為0.513，比對照組低49.95%。差異極顯著（P<0.01）。

與對照組相比，發(fā)酵液處理組的C. gloeosporioides菌體還原糖含量無明顯變化。發(fā)酵液處理24.0 h，胞內(nèi)還原糖含量（A540=0.047）明顯低于對照組（A540=0.374），差異極顯著（P<0.01）。表明T. viride發(fā)酵液可阻礙C. gloeosporioides從環(huán)境中吸收還原糖或加速胞內(nèi)還原糖的滲漏，進而抑制C. gloeosporioides正常生長。

3 討 論

木霉競爭和生存力強，可有效抑制病原菌生長，防治土傳病害[24]。拮抗機制主要有競爭作用、重寄生作用、產(chǎn)生抗生物質(zhì)和溶菌酶類4種[25]。Golam等[26]研究發(fā)現(xiàn)：木霉菌可直接侵入或纏繞在菌絲上，引起病原菌細胞膨大、變形、縮短或變圓，原生質(zhì)收縮，細胞壁破裂。此外，木霉產(chǎn)生的細胞壁溶解酶，可在寄主誘導(dǎo)下趨向生長，在接觸、纏繞和穿透過程中分泌各種降解酶，如纖維素酶（cellulases）、葡聚糖酶（glucanases）、木糖酶（rylanases）和幾丁質(zhì)酶（chitinases）[27]。綜上所述，T. viride發(fā)酵液的有效抑菌成分可能為多肽類、萜類等物質(zhì)。由圖1可見，T. viride對C. gloeosporioides生長抑制效果顯著，因此，本文通過研究T. viride發(fā)酵液處理后C. gloeosporioides細胞結(jié)構(gòu)完整性相關(guān)指標的變化趨勢，對T. viride發(fā)酵液抑菌機制做進一步的考證。

抗菌物質(zhì)對病原真菌菌絲生長的抑制作用主要表現(xiàn)在菌絲隔膜處斷裂，菌絲形態(tài)改變[28-30]。顯微觀察證實：經(jīng)T. viride發(fā)酵液處理后C. gloeosporioides菌絲數(shù)量減少，出現(xiàn)褶皺、空腔、嚴重變形、細胞內(nèi)容物滲漏等現(xiàn)象。在處理初期，可抑制C. gloeosporioides菌絲生長，較長時間處理可使其完全停止生長，甚至死亡。進一步研究表明：T. viride發(fā)酵液可有效抑制C. gloeosporioides孢子的形成和萌發(fā)。處理組培養(yǎng)6.0、12.0、18.0、24.0、30.0 h，C. gloeosporioides孢子萌發(fā)率分別為1.62%、3.63%、6.54%、8.49%、12.53%，比對照組降低7.95、11.69、28.89、45.08、86.40百分點。高偉等[21]的研究也證實：海洋芽孢桿菌可誘使茄鏈格孢菌孢子及芽管頂端膨大成包囊，引起細胞壁破裂，細胞質(zhì)外流。

磷元素是維持微生物正常生長及核酸、磷脂和糖代謝的重要物質(zhì)，在能量代謝中具有核心作用。試驗表明：T. viride 發(fā)酵液可顯著降低C. gloeosporioide對磷的吸收。在0.0～12.0 h內(nèi)，試驗組磷含量基本不發(fā)生變化，對照組磷含量下降58.97個百分點。T. viride 發(fā)酵液中的抑菌活性成分可能穿過病原菌細胞壁及細胞膜屏障進入細胞并到達特定的作用位點，與磷代謝相關(guān)的酶或亞細胞結(jié)構(gòu)等靶目標結(jié)合形成復(fù)合物，阻礙了磷吸收；或競爭性抑制了ATP合成酶的活性，使ATP合成受阻，磷的利用率降低，一系列的糖代謝及能量代謝過程無法有效運行，病原菌無法正常分解利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分，具體機制有待研究。

正常的細胞通透性使微生物攝取胞外物質(zhì)，排出胞內(nèi)物質(zhì)，維持正常生理功能。陳威等[31]研究發(fā)現(xiàn)：金黃色葡萄球菌和白色念珠菌經(jīng)殼聚糖處理后內(nèi)部鉀離子和ATP滲漏，抑菌物質(zhì)可能作用于細胞膜引起蛋白質(zhì)、核酸等外流。由圖3可知，T. viride 發(fā)酵液處理30.0 h，處理組培養(yǎng)基A260、A280分別比對照組高73.40、36.17百分點。處理36.0 h，C. gloeosporioides胞內(nèi)可溶性蛋白比對照組低49.95百分點。這與楊合同等[8]、周紅姿等[32]的研究結(jié)果相符?？赡苡捎赥. viride發(fā)酵液誘導(dǎo)抑制了C. gloeosporioides的某些基因表達或者不表達，導(dǎo)致了相關(guān)蛋白產(chǎn)物的減少，而且這種誘導(dǎo)處理還可破壞細胞結(jié)構(gòu)的完整性，致使可溶性蛋白滲漏，故T. viride發(fā)酵液處理后C. gloeosporioides胞內(nèi)可溶性蛋白含量遠低于對照組。還原糖測定試驗表明：T. viride發(fā)酵液處理24.0 h，C. gloeosporioides胞內(nèi)還原糖含量（A540=0.047）顯著低于對照組（A540=0.374），說明經(jīng)發(fā)酵液處理后杧果炭疽菌對糖的吸收利用率下降，導(dǎo)致能量代謝受阻，進而生長受到抑制。Bruno等[33]研究也表明，受抑制的墨綠霉（Trichoderma atroviride） 還原糖含量明顯少于未處理組。以上試驗證實：T. viride發(fā)酵液使C. gloeosporioides細胞膜通透性異常，細胞結(jié)構(gòu)完整性破壞。

4 結(jié) 論

C. gloeosporioides是杧果生產(chǎn)中最流行，也是危害最嚴重的植物病害。T. viride 發(fā)酵液可以抑制C. gloeosporioides菌絲生長，孢子萌發(fā)，破壞其細胞壁及細胞膜結(jié)構(gòu)，增加細胞通透性，使磷的吸收基本停止，胞內(nèi)核酸、總蛋白、可溶性蛋白滲漏，實現(xiàn)對C. gloeosporioides的抑菌或殺菌目的。（本文圖版見插1）

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