[摘要] 目的 探討外源性磷酸肌酸鈉（CP）對(duì)缺血再灌注肢體的保護(hù)作用。 方法 健康成年家兔20只，隨機(jī)分為對(duì)照組、缺血再灌注組（IR）、低濃度磷酸肌酸鈉組（LCP)和高濃度磷酸肌酸鈉組（HCP），每組5只。制備兔左后肢缺血再灌注模型。靜脈注射生理鹽水和不同濃度的CP，再灌注前、后不同時(shí)間取血測(cè)定血清乳酸脫氫酶(LDH)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙二醛(MDA)的含量及超氧化物歧化酶(SOD)活力。電鏡觀察肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。 結(jié)果 缺血再灌注后LCP和HCP組LDH、AST、MDA含量低于IR（P＜0.05），SOD活力顯著高于IR（P＜0.01）；電鏡下LCP和HCP組肌損傷輕于IR組。 結(jié)論 外源性磷酸肌酸鈉能夠保護(hù)缺血再灌注骨骼肌。

[關(guān)鍵詞] 外源性磷酸肌酸鈉；兔；骨骼肌；再灌注損傷

[中圖分類號(hào)] R541 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2011）36-08-02

Protective Effects of Creatine Phosphate on Ischemia and Reperfusion Injury of Limbs

LIU Mingming1 DING Ming2

1.The Anesthesiology of Weifang Medical College，Weifang 261041， China； 2.The Anesthesia Department of the 89th Chinese People's Liberation Army Hospital，Weifang 261023，China

[Abstract] Objective To study the protective effect of creatine phosphate on ischemia reperfusion of skeletal muscle. Methods The experimental models of ischemia referfusion injury in extremities were produced in 20 healthy adult rabbits，which were randomly divided into control，reperfusion，low concentration and high concentration with 5 rabbits in each .Isolated left hindlimb of rabbits were used as ischemia-reperfusion models.Normal saline injection， Creatine phosphate 0.5g and 1g were infused intravenously into the three groups just before blood reperfusion. At the points of pre-ischemia，1 and 4 hours after reperfusion，the blood samples were collected respectively for measurements of LDH，AST， MDA and SOD. Meanwhile，the tibialis anterior muscles were harvested for examination of the micro-structure and the ultrastructure by using electron microscope. Results After reperfusion，the contents of AST，LDH，MDA significantly decreased（P＜0.05）and the activity of SOD obviously increased in the HCP and LCP groups compared with reperfusion group（P＜0.01）. The electron microscope examinations showed severe tissue injury in the reperfusion group but mild in HCP and LCP groups. Conclusion Creatine phosphate has a significant protective effect on ischemia reperfusion injury in extremities.

[Key words] Creatine phosphate ；Rabbit； Skeletal muscle；Reperfusion injury

臨床上常見的斷肢(指)再植、軟組織損傷、骨筋膜室綜合征、血栓形成及應(yīng)用止血帶時(shí)間過長(zhǎng)等，均會(huì)引起肢體缺血-再灌注（Ischemia-reperfusion， I-R）損傷[1]。磷酸肌酸鈉作為一種外源性的能量合劑，對(duì)缺血再灌注心肌具有確切保護(hù)作用[2]。但外源性磷酸肌酸鈉對(duì)骨骼肌缺血再灌注損傷的影響尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)制備家兔肢體缺血再灌注損傷模型，探討外源性磷酸肌酸鈉對(duì)肢體缺血再灌注骨骼肌的作用。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物分組與模型建立

健康成年家兔20只，體重2.5～3.5kg，雌雄不限，解放軍第89醫(yī)院動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為對(duì)照組、IR、LCP和HCP，每組5只。

1.2 建立家兔后肢缺血再灌注損傷動(dòng)物模型

3%戊巴比妥鈉30mg/kg靜脈麻醉，參照Crinnion[3]法建立家兔后肢骨骼肌缺血再灌注損傷模型。①對(duì)照組：只解剖出股動(dòng)靜脈，不阻斷不環(huán)扎。②缺血組：恢復(fù)血流前耳緣靜脈給予生理鹽水1mL，再灌注4h。③低濃度組：恢復(fù)血流前給予外源性磷酸肌酸鈉溶液（北京利祥制藥有限公司生產(chǎn)，0.5mg，生產(chǎn)批號(hào)100602）0.5g/mL 1mL，再灌注4h。④高濃度組：恢復(fù)血流灌注前給予外源性磷酸肌酸鈉1g/mL 1mL，再灌注4h。

1.3檢測(cè)項(xiàng)目及方法

四組分別于缺血前、缺血再灌注1h、再灌注4h，3個(gè)時(shí)相點(diǎn)采血并制備電鏡標(biāo)本。

1.3.1生化指標(biāo)檢測(cè) AST、LDH的測(cè)定采用羅氏P800全自動(dòng)生化分析儀。MDA和SOD測(cè)定采用硫代巴比妥鈉法和黃嘌呤氧化酶法，試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，嚴(yán)格按照說明書操作。

1.3.2電鏡觀察 將取得的骨骼肌標(biāo)本切成1mm×1mm×1mm大小的組織塊，經(jīng)30g/L戊二醛4℃前固定2h，再經(jīng)鋨酸后固定，梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，鉛鈾雙重染色，透射電鏡觀察并攝片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（χ±s）表示。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，多組樣本均數(shù)間先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，不同組間同一時(shí)間比較采用單因素方差分析，當(dāng)差異明顯時(shí)進(jìn)一步比較采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊則采用Dunnet’s T3法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果

缺血組再灌注后1h、4h，IR組較對(duì)照組AST、LDH、MDA含量明顯升高（P＜0.01），SOD的活力明顯下降（P＜0.01）；缺血再灌注后1h和4h，HCP和LCP組AST、LDH、MDA含量較IR組降低（P＜0.05），SOD的活力明顯增高（P＜0.01）。見表1。

2.2 電鏡結(jié)果

再灌注后4h，IR組顯示線粒體呈明顯空泡樣變，可見明顯髓樣變，線粒體嵴斷裂、消失。LCP組仍可見相當(dāng)正常結(jié)構(gòu)肌組織，但線粒體部分呈空泡樣變、髓樣變，部分線粒體嵴斷裂。HCP組肌組織基本完整，線粒體未見明顯損傷變性。

3討論

肢體缺血再灌注損傷指肢體缺血達(dá)到一定時(shí)間，在恢復(fù)血供后反而出現(xiàn)比缺血時(shí)更加嚴(yán)重的損傷，表現(xiàn)為組織結(jié)構(gòu)與功能損害的進(jìn)一步加重。缺血再灌注損傷是個(gè)多機(jī)制參與的損傷過程，能量代謝障礙、鈣離子超載、氧自由基、白細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)等在骨骼肌缺血再灌注損傷中起關(guān)鍵作用[4]。

正常肌細(xì)胞內(nèi)含豐富的AST、LDH，肌細(xì)胞受損后酶可釋放入血，其含量高低可反映細(xì)胞損傷的程度。SOD可有效清除氧自由基，反映機(jī)體抗氧化能力； MDA是脂質(zhì)過氧化作用的最終產(chǎn)物，其含量可間接反映氧自由基對(duì)機(jī)體造成的損傷程度。SOD和MDA是反映氧化損傷的指標(biāo)[5]。

線粒體在缺血再灌注損傷發(fā)生及其發(fā)展中決定細(xì)胞存亡的關(guān)鍵[6]。CP可以抑制5’-核苷酸酶的活性，使溶血磷脂酸甘油脂濃度下降，穩(wěn)定磷脂膜。CP維持呼吸鏈正常氧化磷脂化功能保證ATP高水平，使氧自由基生產(chǎn)減少，保護(hù)機(jī)體免受氧自由基損傷[7，8]。

本次實(shí)驗(yàn)顯示，缺血再灌注后IR組AST、LDH、MDA含量較對(duì)照組明顯升高（P＜0.05），SOD活力較對(duì)照組明顯降低（P＜0.01），說明IR組骨骼肌在缺血再灌注后發(fā)生了脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，細(xì)胞膜損傷嚴(yán)重。LCP組和HCP組缺血再灌注后AST、LDH、MDA含量較IR組降低（P＜0.05），SOD活力升高顯著（P＜0.01）。經(jīng)電鏡形態(tài)學(xué)觀察證實(shí)在缺血再灌注4h后IR組細(xì)胞損傷明顯，LCP組細(xì)胞損傷較IR組減輕，HCP組幾乎接近正常組織細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)說明應(yīng)用外源性磷酸肌酸鈉能減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，組織清除自由基能力增強(qiáng)，減輕線粒體的損傷，對(duì)肢體缺血再灌注損傷有顯著的保護(hù)作用。本研究為外源性磷酸肌酸鈉在肢體缺血再灌注損傷保護(hù)方面，提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但最佳保護(hù)劑量還有待進(jìn)一步探索。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Wang X，Kan S，Zhang B. Pathological changes in neuromuscular junction during ischemia-reperfusion in rat skeletal muscle[J]. Zhong

uoxiufuchongjian waikezazhi，2006，20（11）：1103-1108.

[2] 周麗昉， 高長(zhǎng)斌.磷酸肌酸對(duì)大鼠缺血再灌注后心肌損傷的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志， 2010， 31（5）:1609-1610.

[3] Crinnion JN，Homer VS，Parkin SM，et al．Role of neutrphilendothelial adhesion in skeletal muscle reperfusion injury[J]. Br J Surg，1996，83（2）：251．

[4] 洪念國(guó)，田中偉，李濤，等. 斷肢再植缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制[J]. 河南科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，24（9）:171.

[5] 呼敏鳳，尚立芝，韋大文. 川芎嗪預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 上海中醫(yī)藥雜志，2008，42（4）:66.

[6] Kroemer G，Galuzzi L，Brenner C. Mitochondrial membrane permeabilizationin cell death[J]. Physiol Rev，2007，87:99-163.

[7] 常建華，景桂霞，黨旭云. 磷酸肌酸預(yù)處理對(duì)糖尿病大鼠心臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制[J]. 西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2011，32（2）:151-154.

[8] 李薇，王德勝，陳彩鳳，等. 外源性磷酸肌酸對(duì)重度窒息新生兒血清MBP與NSE水平的影響[J]. 現(xiàn)代醫(yī)院2006，6（4）:18-20.

（收稿日期：2011-10-19）