摘要人體系統(tǒng)循環(huán)中的25-羥基維生素D2（25(OH)D2）和25-羥基維生素D3（25(OH)D3）濃度反映著人體內(nèi)的維生素D狀態(tài)。本綜述旨在對使用LC-MS/MS法分析人體內(nèi)25(OH)D濃度的方法進(jìn)行全面的綜述和評價。通過搜索數(shù)據(jù)庫共篩選到20篇相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)同位素內(nèi)標(biāo)的選擇、質(zhì)譜離子源、衍生化、母離子的選擇、基質(zhì)效應(yīng)和干擾物分離等因素會影響分析的準(zhǔn)確度和靈敏度。為了建立一個靈敏和準(zhǔn)確的分析方法，需要對上述影響因素進(jìn)行優(yōu)化。

關(guān)鍵詞25-羥基維生素D2 25-羥基維生素D3 LC-MS/MS法 同位素內(nèi)標(biāo) 基質(zhì)效應(yīng)

中圖分類號：O657；Q565 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-1533(2011)10-0477-04

1維生素D的生理效應(yīng)及體內(nèi)特點

維生素D是一個脂溶性維生素，在維持人體內(nèi)鈣的動態(tài)平衡方面起著非常重要的作用，能和鈣一起促進(jìn)兒童骨骼的形成和維持成人骨骼的強(qiáng)度。在兒童中，維生素D的缺乏會導(dǎo)致骨骼畸形，如出現(xiàn)佝僂病等；而在成人中，維生素D的缺乏會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥[1]。最近有研究證實，血清中維生素D濃度高與較低的乳腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌的發(fā)生率有顯著的相關(guān)性[2]。維生素D缺乏也可能是一個潛在的心血管疾病危險因素[3]。

維生素D主要存在兩種形式，分別為維生素D2和維生素D3。對絕大部分人來講，人體在陽光照射下皮膚中形成維生素D是維生素D3的主要來源，而維生素D2主要存在于各種食物和植物中。這兩種維生素D都會在肝臟中被代謝形成25-羥基維生素D（25(OH)D），然后在腎臟中進(jìn)一步被代謝形成1，25-二羥基維生素D（1，25(OH)2D）[1]。維生素D及其代謝產(chǎn)物主要和血中的維生素D結(jié)合蛋白結(jié)合，只有0.03%的25(OH)D是以游離形式存在的[1]。由于維生素D和1，25(OH)2D的半衰期相對較短（＜2 d），故系統(tǒng)循環(huán)中的25(OH)D被認(rèn)為是反映人體內(nèi)維生素D水平的重要指標(biāo)[1， 4]。人血清中正常的25(OH)D濃度約為10～50 ng/ml，而高濃度的25(OH)D（＞200 ng/ml）可能與毒性和不良的健康狀況有關(guān)[5]。

2分析25(OH)D的方法

目前有很多不同的分析技術(shù)和方法可用于分析人體內(nèi)的25(OH)D濃度，其中酶免疫分析法曾經(jīng)是檢測血清中25(OH)D濃度的最主要方法，且至今仍在被廣泛應(yīng)用[6]。酶免疫分析法的主要缺陷是抗體之間的交叉反應(yīng)導(dǎo)致的方法特異性不足，而色譜分析法可對這些分析物進(jìn)行有效分離，從而獲得足夠的特異性。在這一方面，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）法有很大的優(yōu)勢。由于LC-MS/MS法的高選擇性、特異性和靈敏度，目前該分析技術(shù)已越來越廣泛地用于臨床檢驗實驗室中對25(OH)D的分析。

3LC-MS/MS法分析人體內(nèi)25(OH)D的研究現(xiàn)狀

鑒于LC-MS/MS法在分析25(OH)D2和25(OH)D3時的獨特優(yōu)勢，對近10年內(nèi)發(fā)表的相關(guān)英文文獻(xiàn)進(jìn)行搜索，發(fā)現(xiàn)采用LC-MS/MS法分析人體內(nèi)25(OH)D的研究在最近兩年內(nèi)有顯著增長。筆者共獲得20篇相關(guān)英文文獻(xiàn)[7~26]，下面就LC-MS/MS法分析人體內(nèi)25(OH)D的研究作一全面的系統(tǒng)綜述和評價，并對影響檢測靈敏度和準(zhǔn)確度的關(guān)鍵影響因素進(jìn)行分析。

3.1針對不同人體生物樣品的LC-MS/MS法分析策略

大部分研究分析的生物樣品均是人血清或血漿，但是有一項研究的分析樣品是人的唾液[9]。人唾液中25(OH)D2或25(OH)D3的濃度顯著低于血清中的濃度，故對分析的靈敏度提出了更高的要求。這項研究實際上是目前已經(jīng)報道的最靈敏的分析方法，柱上絕對靈敏度達(dá)到了0.7 pg。為了獲得高靈敏度，這項研究使用了Cookson試劑（4位取代的1，2，3-三唑啉-3，5-二酮）對25(OH)D進(jìn)行衍生化反應(yīng)。25(OH)D2或25(OH)D3本身在電噴霧電離（ESI）下很難被電離，而通過衍生化反應(yīng)加上一個含豐富N原子的基團(tuán)后，這一含N基團(tuán)會使衍生化產(chǎn)物在正離子ESI下很容易形成加氫峰[M+H]+，從而大大提高分析的靈敏度（提高達(dá)100倍）。在此基礎(chǔ)上，該研究又通過在流動相中加入少量甲胺，使得衍生化產(chǎn)物形成甲胺加合離子[M+CH3NH3]+，后者的形成降低了加氫峰和脫水產(chǎn)物的離子強(qiáng)度，進(jìn)一步提高了分析的靈敏度。但該研究的樣品處理過于復(fù)雜。另有兩項研究分析的樣品是人的干血點[10， 15]。干血點法（DBS）的主要優(yōu)點是用血量少（如只需3.28 μl全血）、樣品容易保存和運輸，但對分析的要求也很高。為了保證分析的靈敏度，這兩項研究同樣采用了衍生化的樣品處理方法。

3.2對于提高LC-MS/MS法分析準(zhǔn)確度的研究現(xiàn)狀及存在問題

從不同研究的內(nèi)標(biāo)選擇來看，大部分研究使用了同位素內(nèi)標(biāo)，但是有5項研究沒有使用同位素內(nèi)標(biāo)[7~11]。這些研究所選擇的內(nèi)標(biāo)均為25(OH)D的結(jié)構(gòu)類似物，同時這些研究還均沒有考察基質(zhì)效應(yīng)。因此，這些研究的分析準(zhǔn)確性可能受基質(zhì)效應(yīng)的影響。雖然大部分研究使用了同位素內(nèi)標(biāo)，但是其中有6項研究[12~15， 17， 24]僅使用了單個同位素內(nèi)標(biāo)。僅使用一個同位素內(nèi)標(biāo)不能滿足兩個或兩個以上待測物的分析需求。其它研究均使用了多個同位素內(nèi)標(biāo)，每個待測物對應(yīng)一個同位素內(nèi)標(biāo)。

在ESI源中，基質(zhì)效應(yīng)是一個必須要考慮的問題，而在大氣壓化學(xué)電離（APCI）或大氣壓光致電離（APPI）源中一般不存在顯著的基質(zhì)效應(yīng)。在13項使用ESI源的研究中只有4項研究對基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了考察[18， 19， 23， 25]，在未考察基質(zhì)效應(yīng)的9項研究中有4項研究沒有使用同位素內(nèi)標(biāo)[8~11]，另有4項研究只使用了單個同位素內(nèi)標(biāo)分析兩個待分析物[13， 15， 17， 24]。這說明在分析人的生物樣品中25(OH)D2和25(OH)D3的濃度時，絕大部分研究都忽視了對ESI源的基質(zhì)效應(yīng)的考察，很可能會對分析方法的準(zhǔn)確性產(chǎn)生一定程度的影響。

在所有20項研究中，只有6項研究考察了內(nèi)源性的同分異構(gòu)體對25(OH)D3的分析干擾[10， 11， 13， 14， 23， 26]，且這6項研究中只有兩項研究的考察比較系統(tǒng)和全面[11， 23]。這兩項研究均采用了較為復(fù)雜的二維液相色譜進(jìn)行分離，從而大大提高了分析物和干擾物之間的分離效果。目前已知能夠干擾25(OH)D3分析的內(nèi)源性成分主要是1α-羥基維生素D3、3-表-25(OH)D3和7α-羥基-4-膽甾烯-3-酮。總體來看，對內(nèi)源性干擾物的研究現(xiàn)狀不能令人滿意，大部分研究均忽視了對干擾物的色譜分離，很可能會影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

質(zhì)譜儀的選擇對分析準(zhǔn)確度也有一定的影響，除了一項研究使用離子阱質(zhì)譜儀外[7]，其它研究均選擇了串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀或串聯(lián)四級桿線性離子阱質(zhì)譜儀。選擇普通離子阱質(zhì)譜儀對25(OH)D2或25(OH)D3進(jìn)行定量分析是不合適的，會影響分析的準(zhǔn)確度和可靠性。

3.3對于提高LC-MS/MS分析靈敏度的研究現(xiàn)狀及存在問題

為了獲得較好的分離度和靈敏度，共有6項研究使用了超高效液相色譜儀[11， 16~18， 23， 24]，有一項研究為了進(jìn)一步提高靈敏度甚至使用了毛細(xì)管微流液相色譜儀。毛細(xì)管微流液相色譜儀的流速單位通常是μl/min，低流速可以大大降低對樣品的稀釋程度，從而提高質(zhì)譜檢測的靈敏度。毛細(xì)管微流液相色譜法的主要局限性是樣品載荷能力有限，故對樣品的前處理要求很高，在樣品前處理時需要最大程度地去除樣品干擾基質(zhì)。其它研究均采用了普通的高效液相色譜儀。

對離子源，在不同的分析條件下需要進(jìn)行不同的選擇。比如，有的研究為了提高分析靈敏度進(jìn)行了衍生化反應(yīng)，而衍生化產(chǎn)物在正離子ESI下具有很好的質(zhì)譜響應(yīng)，故凡涉及到衍生化處理的分析方法均采用了正離子ESI進(jìn)行質(zhì)譜檢測。在沒有采用衍生化的分析方法（12項研究）中，有的采用ESI模式（6項研究），有的選擇了APCI模式（4項研究）或APPI模式（2項研究）?？偟膩碚f，ESI和APCI（或APPI）兩種模式下的分析靈敏度似乎差別不大。但需注意的是，APPI下的分析靈敏度要顯著高于APCI下的靈敏度[21， 22]。因此，如要建立一個不需衍生化的簡單的分析方法，建議選擇APPI源進(jìn)行檢測。

在不同類型的檢測模式下（ESI或APCI），所選擇的流動相中的電解質(zhì)種類也不同。在ESI模式下，為了讓分析物形成[M+H]+或[M+CH3NH3]+，一般在流動相中加入0.1%的甲酸或5 mM的甲胺；而在APCI或APPI模式下，一般不在流動相中添加任何電解質(zhì)，但有兩項研究分別在流動相中添加了甲酸（10 mM）和甲苯（1%）[22， 23]。需指出的是，使用甲苯作為流動相添加劑的研究使用了APPI電離模式，該研究發(fā)現(xiàn)在流動相中添加甲苯能顯著提高分析的靈敏度。

為了提高分析的靈敏度，總共20項研究中有8項研究使用了柱前衍生化的方法[7， 9， 10， 15， 16， 18， 19， 25]。對所有20項研究的靈敏度從高到低進(jìn)行排序后發(fā)現(xiàn)，靈敏度最高的6項研究均采用了衍生化的方法，說明衍生化方法能顯著提高分析的靈敏度[9， 10， 15， 16， 18， 19]。衍生化試劑均采用Cookson試劑，而25(OH)D2和25(OH)D3的衍生化產(chǎn)物均存在6S和6R兩種構(gòu)型。為了滿足分析的準(zhǔn)確性的要求，必須對這兩種同分異構(gòu)體進(jìn)行色譜分離。有的研究對這兩種同分異構(gòu)體進(jìn)行了色譜分離[16]，但也有研究對這兩種物質(zhì)的分離效果不是很理想、至少沒有達(dá)到基線分離[15]。8項使用衍生化反應(yīng)的研究中有6項使用了4-苯基-1，2，3-三唑啉-3，5-二酮（PTAD）。需指出的是，有一項研究的衍生化反應(yīng)是分兩步進(jìn)行的：第一步使用PTAD進(jìn)行Diels–Alder反應(yīng)，第二步對3位上的羥基進(jìn)行乙?；磻?yīng)[10]。進(jìn)行乙?；磻?yīng)的目的是為了對25(OH)D3和3-表-25(OH)D3進(jìn)行更好的色譜分離。3-表-25(OH)D3是25(OH)D3的同分異構(gòu)體，會干擾25(OH)D3的準(zhǔn)確定量。

檢測母離子的選擇同樣會影響分析靈敏度。在非衍生化的分析方法中，除了一項研究選擇加氫脫水峰[M-H2O+H]+作為母離子進(jìn)行檢測外[21]，其它研究均選擇[M+H]+作為母離子進(jìn)行檢測。這說明在非衍生化條件下，25(OH)D2或25(OH)D3在ESI源中主要形成的是[M+H]+。而在衍生化的8項研究中，有4項研究選擇了[M-H2O+H]+作為母離子進(jìn)行檢測[15， 16， 19， 25]，其它3項研究為了提高分析靈敏度，在流動相中添加了一定量的甲胺[9， 10， 18]，使得分析物形成響應(yīng)較高的[M+CH3NH3]+。

3.4生物樣品的前處理方法

對于生物樣品的前處理，絕大部分研究的前處理方法均比較復(fù)雜，一般程序是：1）用甲醇、乙腈或其它有機(jī)試劑對血樣進(jìn)行蛋白沉淀，將與蛋白結(jié)合的25(OH)D釋放出來。有一項研究在蛋白沉淀前專門使用了氫氧化鈉來釋放與蛋白結(jié)合的25(OH)D[24]，但此似無必要。2）采用液-液萃取或固相萃取法提取25(OH)D。有的研究在這一步采用了在線自動固相萃取法。3）有的研究會進(jìn)行衍生化處理。4）濃縮和復(fù)溶。有3項研究采用了非常簡便的樣品處理方法，這些研究均在采用乙腈或丙酮沉淀蛋白后直接進(jìn)行分析或濃縮后分析[20~22]，且分析方法的靈敏度能夠滿足分析人血清中25(OH)D的要求。必須指出的是，這三項研究均采用了APCI或APPI模式，同時選擇的質(zhì)譜儀也是較新一代的質(zhì)譜儀，如API 4000、API 5000或Agilent 6460。

4結(jié)論

為了建立一個高靈敏度的人血清中25(OH)D2和25(OH)D3的LC-MS/MS分析方法，最好選擇衍生化的樣品處理方法，并選擇正離子ESI源檢測[M+CH3NH3]+（流動相添加甲胺）或[M-H2O+H]+（流動相添加甲酸）作為母離子。為了提高分析的準(zhǔn)確性，必須對所有可能的內(nèi)源性干擾物和分析物25(OH)D進(jìn)行色譜分離，每個待分析物都要有相應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)，對基質(zhì)效應(yīng)也必須進(jìn)行系統(tǒng)的考察。如果發(fā)現(xiàn)有基質(zhì)效應(yīng)，應(yīng)采取措施予于克服。如要建立一個簡便的分析方法（沉淀蛋白后直接進(jìn)樣分析而不進(jìn)行衍生化反應(yīng)），應(yīng)選擇較新一代的串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀，再結(jié)合使用APPI源檢測[M+H]+（流動相不添加電解質(zhì)）作為母離子，可以滿足對人血清中25(OH)D的分析需求。

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（收稿日期：2011-08-12）