趙慧芳，方 亮，吳文龍，李維林

〔江蘇省·中國科學院植物研究所(南京中山植物園)，江蘇 南京 210014〕

近年來，抗氧化劑廣泛用于食品、化妝品行業(yè)，需求量逐年增加，開發(fā)安全、高效的天然抗氧化劑成為現(xiàn)代工業(yè)的一項重大課題。黑莓(Rubus spp.)原產(chǎn)北美，果實柔嫩多汁、酸甜爽口、風味獨特、色澤艷麗、營養(yǎng)豐富，富含色素等多酚類物質(zhì)，具有較強的抗癌、抗衰老、抗氧化和清除自由基的作用［1－3］，其鮮果和加工品深受歐美消費者的青睞。

植物提取成分的體外抗氧化活性測定方法有很多，其中，近年來發(fā)展起來的1，1－二苯基－2－苦基肼自由基(DPPH·)分光光度法簡便、靈敏、穩(wěn)定，在國內(nèi)外已廣泛應(yīng)用［4－7］。利用該法進行測定時，大部分學者采用固定反應(yīng)時間的方式進行測定［8－10］。筆者在研究中發(fā)現(xiàn)，在固定反應(yīng)時間內(nèi)(如30或 40 min)，無論是對照品2，6－二叔丁基對甲酚(BHT)還是供試樣品(黑莓果實水提物)，與DPPH·的反應(yīng)并未達到終點；很多研究結(jié)果也表明，不同抗氧化劑清除DPPH·的速率是有差異的。因此，在定量測定合成或天然抗氧化劑對DPPH·的清除能力時，首先要進行反應(yīng)動力學研究以確定其達到穩(wěn)定態(tài)時所需的反應(yīng)時間。

作者以VC和BHT為對照，通過DPPH·分光光度法研究了黑莓品種‘Boysen’果實水提物及色素與DPPH·的反應(yīng)動力學特性，并依據(jù)反應(yīng)動力學結(jié)果比較二者對DPPH·清除能力的差異，以期為黑莓鮮果及其制品抗氧化性能的研究及深度開發(fā)提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試的黑莓品種‘Boysen’果實于2009年采自江蘇省·中國科學院植物研究所黑莓品種園，于－38℃速凍后于－18℃保存、備用。

DPPH·標準品(純度大于99％)由美國Sigma公司生產(chǎn)，VC和BHT均為分析純。所用儀器有：TU－1810紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)、KQ－100DE數(shù)控超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)和PL－5－B型低速離心機(上海安亭科學儀器廠)等。

1.2 方法

1.2.1 DPPH·標準曲線的繪制 精確稱取DPPH·標準品4.5 mg，用無水乙醇配制濃度為115μmol·L－1的DPPH·標準品母液。分別吸取2.0 mL標準品母液，用無水乙醇稀釋至濃度分別為115、76、57、46、38和32μmol·L－1，于517 nm處測定吸光度。以濃度x為橫坐標、吸光度y為縱坐標繪制標準曲線?；貧w方程為y=0.010 5x+0.013 2，R2=0.997 1(極顯著相關(guān))，說明在32～115μmol·L－1濃度范圍內(nèi)DPPH ·與吸光度具有較好的線性關(guān)系。

1.2.2 黑莓果實水提物和色素的制備 速凍果經(jīng)解凍、打漿，以質(zhì)量體積比1∶9的比例將果漿和純凈水混合，于40℃超聲(功率60W)提取40 min后，4 000 r·min－1離心10 min，上清液即為果實水提物，配制成質(zhì)量濃度分別為10.00、12.50、16.67、25.00、50.00和100.00 g·L－1的溶液備用。

參照文獻［11］的方法制得果實色素粉末，經(jīng)pH示差法［12］測得總花色苷含量為(18.50±0.85)％。精確稱取黑莓色素制品0.050 0 g，分別用體積分數(shù)50％乙醇溶解并定容至250 mL，逐步稀釋為質(zhì)量濃度0.03、0.06、0.11、0.13、0.16和0.21 g·L－1的溶液備用。

1.2.3 反應(yīng)動力學研究 用無水乙醇配制質(zhì)量濃度0.51、0.81、1.01、1.35、2.02和4.04 g·L－1的BHT溶液及0.05、0.09、0.10、0.12、0.13和0.26 g·L－1的VC溶液。取不同質(zhì)量濃度的BHT、VC、水提物和色素溶液各200μL，分別加入2.80 mL DPPH·標準品母液，采用動力學監(jiān)測法，以無水乙醇為空白，于517 nm處測定不同反應(yīng)時間溶液的吸光度(Ai)，其中，0～5 min隔30 s測定1次，5～10min隔60 s測定1次，10～30 min隔5 min測定1次，30 min之后隔10 min測定1次，待吸光度基本不變(前后2次差值小于0.01％)時視為樣品與自由基反應(yīng)完全，所有動力學實驗均在10℃條件下進行。另外，按同法分別測定200μL無水乙醇加2.80 mL DPPH·母液在517 nm下的吸光度(AC)和200μL供試溶液加2.80mL無水乙醇在517 nm下的吸光度(Aj)。按照公式計算自由基清除率［7］：清除率=〔1－(Ai－Aj)/AC〕×100％。

反應(yīng)速率常數(shù)(k)的確定：根據(jù)反應(yīng)動力學原理，一級反應(yīng)符合方程v=－dc/dt=kc和ln(c)=－kc〔其中，v為反應(yīng)速率；c為DPPH·濃度(μmol·L－1)；t為反應(yīng)時間〕，即以ln(c)對t作圖，直線的斜率即為－k，反應(yīng)速率常數(shù)k值越大說明反應(yīng)速率越快［13－14］。根據(jù)反應(yīng)速率常數(shù)確定反應(yīng)到達終點所需的時間。

1.2.4 清除自由基能力的計算 根據(jù)不同質(zhì)量濃度供試溶液清除DPPH·的曲線，計算得出DPPH·初始濃度減少至50％時所對應(yīng)的供試品質(zhì)量濃度即為半數(shù)有效濃度(EC50)［15］。根據(jù)EC50及此時對應(yīng)清除DPPH·的量，計算總抗氧化能力值(TCA)［16］，即在半數(shù)有效濃度下1 mL供試溶液清除DPPH·的量。

根據(jù)EC50及在此濃度下反應(yīng)達到終點所需的時間，求得供試樣品的清除自由基能力(AE)［5，17］，AE值越大，表明供試品清除自由基的能力越強。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003分析軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計、計算和分析，并繪制BHT、VC、果實水提物和色素清除DPPH·的動力學曲線及清除率曲線。

2 結(jié)果和分析

2.1 與DPPH·的反應(yīng)動力學特性比較

2.1.1 BHT和VC對DPPH·的反應(yīng)動力學特性 不同質(zhì)量濃度BHT和VC對DPPH·的反應(yīng)動力學曲線見圖1。0.51～4.04 g·L－1BHT與DPPH·的反應(yīng)在120 min時基本達到穩(wěn)定，而0.05～0.26 g·L－1VC與DPPH·的反應(yīng)均在1 min內(nèi)瞬間完成，連續(xù)測定10 min，各質(zhì)量濃度VC對DPPH·的清除率均維持不變，說明在1 min時反應(yīng)均已結(jié)束。

圖1 不同質(zhì)量濃度BHT和VC對DPPH·的反應(yīng)動力學曲線Fig.1 Reaction kinetic curves of different concentrations of BHT and VC to DPPH·

根據(jù)不同質(zhì)量濃度BHT和VC的反應(yīng)動力學曲線，分別將DPPH·的濃度進行對數(shù)換算。以ln(c)對t作圖，根據(jù)斜率計算反應(yīng)速率常數(shù)k，結(jié)果見表1。由表1可見，在120 min反應(yīng)時間內(nèi)，0.51～4.04 g· L－1BHT對DPPH·的反應(yīng)分為2個階段：第1個階段為0～30 min，反應(yīng)速率較快；第2個階段為30～120 min，反應(yīng)速率較慢。在第1個反應(yīng)階段中，4.04 g·L－1BHT與DPPH·的反應(yīng)速率常數(shù)k1為0.028 5μmol·L－1·min－1；隨著 BHT質(zhì)量濃度的降低，k1逐漸降低，當BHT質(zhì)量濃度達到0.51 g·L－1時，k1僅為0.004 1μmol·L－1·min－1。在第2個反應(yīng)階段中，隨BHT質(zhì)量濃度的降低，反應(yīng)速率常數(shù)k2整體上也呈逐漸降低的趨勢，但k2明顯低于k1。由于實驗條件的限制，動力學反應(yīng)只持續(xù)進行了120 min，第2個反應(yīng)階段的k2為0.002 3～0.008 1μmol·L－1·min－1，均大于0.001μmol·L－1·min－1，據(jù)此推測該反應(yīng)可能還存在反應(yīng)速率常數(shù)更低的第3反應(yīng)階段，這與Bondet等［18］報道的“BHT對DPPH·的反應(yīng)屬于慢反應(yīng)過程”是一致的。

表1 不同質(zhì)量濃度VC和BHT對DPPH·的反應(yīng)動力學特征1)Table 1 Reaction kinetic property of different concentrations of VC and BHT to DPPH·1)

0.05～0.26 g·L－1VC對DPPH·反應(yīng)的反應(yīng)速率常數(shù)在0～1 min內(nèi)均較大，0.05 g·L－1VC對DPPH·的反應(yīng)速率常數(shù)k1為38.598μmol·L－1·min－1，隨著VC質(zhì)量濃度的提高k1逐漸增大，0.26 g·L－1VC對DPPH·的k1最高，達111.590μmol·L－1·min－1，表明VC對DPPH·的清除反應(yīng)為瞬時反應(yīng)。

2.1.2 黑莓果實水提物和色素對DPPH·的反應(yīng)動力學特性 黑莓品種‘Boysen’果實的不同質(zhì)量濃度水提物和色素對DPPH·的反應(yīng)動力學曲線見圖2。10.00～100.00 g·L－1水提物和0.03～0.21 g·L－1色素對DPPH·的反應(yīng)均在100 min時趨于穩(wěn)定。

根據(jù)水提物和色素與DPPH·的反應(yīng)動力學曲線，可將10.00～100.00 g·L－1水 提 物 或0.03～0.21 g·L－1色素與DPPH·的整個反應(yīng)均分為3個階段，各反應(yīng)階段的反應(yīng)速率常數(shù)見表2。

100.00 g·L－1水提物與DPPH·的反應(yīng)于28 min趨于穩(wěn)定，整個反應(yīng)可分為0～4、4～10和10～28 min 3個反應(yīng)階段；10.00～50.00 g·L－1水提物與DPPH·的反應(yīng)均在100 min時趨于穩(wěn)定，整個反應(yīng)均可分為0～4、4～30和30～100 min 3個反應(yīng)階段。同一質(zhì)量濃度水提物的反應(yīng)速率常數(shù)由大到小依次為k1、k2、k3，即第1個反應(yīng)階段反應(yīng)速率最快，第2個反應(yīng)階段次之，第3個反應(yīng)階段最慢。3個反應(yīng)階段的反應(yīng)速率常數(shù)均隨水提物質(zhì)量濃度的提高而增大，其中100.00 g·L－1水提物的反應(yīng)速率常數(shù)最大。100.00 g·L－1水提物在第1、第2和第3反應(yīng)階段對應(yīng)的k1、k2和k3均最大，分別為0.327 9、0.152 4和0.042 8μmol·L－1·min－1；在28～100min內(nèi)反應(yīng)速率常數(shù)僅為0.000 7μmol·L－1·min－1，小于0.001 μmol·L－1·min－1，說明28 min時反應(yīng)已結(jié)束。與BHT和VC相比，黑莓果實水提物與DPPH·反應(yīng)的反應(yīng)時間較BHT短，但比VC長；反應(yīng)速率常數(shù)也較BHT大，而比VC小。

圖2 黑莓品種‘Boysen’果實的不同質(zhì)量濃度水提物和色素對DPPH·的反應(yīng)動力學曲線Fig.2 Reaction kinetic curves of different concentrations of aqueous extracts and pigment from blackberry (Rubus spp.)cultivar‘Boysen’fruit to DPPH·

表2 黑莓品種‘Boysen’果實的不同質(zhì)量濃度水提物和色素對DPPH·的反應(yīng)動力學特征1)Table 2 Reaction kinetic property of different concentrations of aqueous extracts and pigment from blackberry(Rubus spp.)cultivar‘Boysen’fruit to DPPH·1)

由表2可見，0.21 g·L－1色素與DPPH·的反應(yīng)在10 min時趨于穩(wěn)定，整個反應(yīng)可分為0～1、1～4和4～10 min 3個階段；0.16 g·L－1色素與DPPH·的反應(yīng)在20 min時趨于穩(wěn)定，整個反應(yīng)可分為0～1、1～6和6～20 min 3個反應(yīng)階段；0.03～0.13 g·L－1色素與DPPH·的反應(yīng)均在100 min時趨于穩(wěn)定，整個反應(yīng)均可分為0～1、1～4和4～100 min 3個階段。隨色素質(zhì)量濃度的提高，第1、第2和第3反應(yīng)階段的反應(yīng)速率常數(shù)逐漸增大；隨反應(yīng)時間的延長，不同質(zhì)量濃度色素在第1、第2和第3反應(yīng)階段的反應(yīng)速率常數(shù)則逐漸減小，0.21 g·L－1色素在第1、第2和第3反應(yīng)階段的k1、k2和k3均最大，分別為1.527 9、0.172 5和0.057 1μmol·L－1·min－1。在第1、第2和第3反應(yīng)階段，不同質(zhì)量濃度黑莓色素的反應(yīng)速率常數(shù)的變化趨勢與黑莓果實水提物相同。

從反應(yīng)速率常數(shù)和反應(yīng)時間上可以看出，黑莓色素與DPPH·的反應(yīng)速率較黑莓果實水提物和BHT高，但低于VC；色素與DPPH·的反應(yīng)速率為水提物的4～7倍，質(zhì)量濃度較高的色素與DPPH·的反應(yīng)在10～20 min時即達到終點，而水提物最少需要28 min，這可能與黑莓果實水提物成分較為復(fù)雜有關(guān)。

2.2 對DPPH·清除作用的比較

2.2.1 BHT和VC對DPPH·的清除作用 根據(jù)反應(yīng)動力學研究結(jié)果，以反應(yīng)120 min時0.51～4.04 g·L－1BHT和反應(yīng)1 min時0.05～0.26 g·L－1VC對DPPH·的清除率為最終清除率，分別繪制不同質(zhì)量濃度BHT和VC對DPPH·的清除率曲線，結(jié)果見圖3。在0.00～1.35 g·L－1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，DPPH·清除率(y)和BHT質(zhì)量濃度(x)的線性關(guān)系良好，回歸方程為y=40.999x，R2=0.958 4，呈極顯著相關(guān)。根據(jù)回歸方程求得BHT的EC50為1.22 g·L－1，在此濃度下，TCA為47.5μmol，AE為6.83×10－3。

在0.00～0.13 g·L－1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，DPPH·清除率(y)和VC質(zhì)量濃度(x)有較好的線性關(guān)系，回歸方程為y=643.99x，R2=0.999 5，呈極顯著相關(guān)。根據(jù)回歸方程求得VC的EC50為7.76×10－2g·L－1，在此濃度下，TCA為724μmol，AE為12.9。

2.2.2 黑莓果實水提物和色素對DPPH·的清除作用

以反應(yīng)100 min時10.00～100.00 g·L－1果實水提物和0.03～0.21 g·L－1色素對DPPH·的清除率為最終清除率，分別繪制不同質(zhì)量濃度水提物和色素對DPPH·的清除率曲線，結(jié)果見圖4。水提物質(zhì)量濃度在0.00～25.00 g·L－1范圍內(nèi)，DPPH·清除率(y)和果實水提物的質(zhì)量濃度(x)線性關(guān)系良好，回歸方程為y=2.497 2x，R2=0.983 4，呈極顯著相關(guān)。根據(jù)回歸方程求得水提物的EC50為20.0 g·L－1，TCA為2.89μmol，AE為4.99×10－4，其中，水提物的EC50高于VC和BHT，而其TCA和AE均較VC和BHT低。

在0.00～0.12 g·L－1范圍內(nèi)，DPPH·清除率(y)和黑莓果實色素質(zhì)量濃度(x)的線性關(guān)系良好，回歸方程為y=698.19x，R2=0.986 8，呈極顯著相關(guān)。根據(jù)回歸方程求得色素的EC50為7.16×10－2g·L－1，遠低于黑莓果實水提物和BHT，與VC接近；TCA為809μmol，分別是VC、BHT和水提物的1.1、17.0和279.9倍；AE為1.40×10－1，低于VC，僅為VC的1.1％，但高于BHT和水提物，分別是BHT和水提物的20.5和280.6倍。

圖3 不同質(zhì)量濃度BHT和VC對DPPH·的清除率曲線Fig.3 Curves of scavenging rate of different concentrations of BHT and VC to DPPH·

圖4 黑莓品種‘Boysen’果實的不同質(zhì)量濃度水提物和色素對DPPH·的清除率曲線Fig.4 Curves of scavenging rate of different concentrations of aqueous extracts and pigment from blackberry (Rubus spp.)cultivar‘Boysen’fruit to DPPH·

3 討論和結(jié)論

植物體內(nèi)的抗氧化體系通常是一個復(fù)合體系，不同物種間或者同一物種不同提取物的抗氧化組分間均存在差異［19］。因此，以DPPH·清除率來表征植物的抗氧化力時應(yīng)充分考慮其反應(yīng)的動力學特點。本實驗結(jié)果表明，不同的抗氧化物對DPPH·的清除速率和反應(yīng)達到平衡所需的時間存在很大差異。VC在瞬間完成反應(yīng)，反應(yīng)速率常數(shù)(k)為38.598～111.590 μmol·L－1·min－1；而BHT與DPPH·的反應(yīng)則為慢反應(yīng)，在0～30 min的反應(yīng)時間內(nèi)，0.51～4.04 g· L－1BHT的k值為0.004 1～0.028 5μmol·L－1· min－1；水提物和色素對DPPH·的清除速率介于VC和BHT之間，在0～4min反應(yīng)時間內(nèi)10～100 g·L－1水提物的k值為0.043 3～0.327 9μmol·L－1·min－1，在0～1 min反應(yīng)時間內(nèi)0.03～0.21 g·L－1色素的k值為0.167 5～1.527 9μmol·L－1·min－1；k值由大到小依次為VC、色素、水提物、BHT。唐勇等［16］的研究結(jié)果表明，在抗氧化劑和DPPH·反應(yīng)的后期，DPPH·濃度的緩慢下降是由于自然衰減引起的。筆者在進行反應(yīng)動力學研究時對空白溶液的吸光度隨時間的變化也進行了測定，未發(fā)現(xiàn)DPPH·的自然衰減現(xiàn)象，因此可以排除這一因素的影響。

一般情況下，在k小于0.001時，即可判定反應(yīng)接近終點。根據(jù)該原理可以確定VC、BHT、黑莓果實水提物和色素與DPPH·反應(yīng)到達終點時所需要的時間，VC僅為1 min，BHT超過120 min，水提物為28～100 min，色素為10～100 min。不同濃度的VC、BHT、水提物和色素對DPPH·的清除速率也有所差異，濃度越高反應(yīng)速率越大，達到反應(yīng)終點所需的時間越短。

以VC和BHT為對照，比較黑莓果實水提物和色素的抗氧化能力，結(jié)果表明，水提物的清除自由基能力較VC和BHT低，但與DPPH·的反應(yīng)速率明顯大于BHT，反應(yīng)時間也較BHT短；色素的EC50較VC低，其TCA是VC的1.1倍，但由于色素和DPPH·反應(yīng)達到終點的時間較VC長，因此色素的清除自由基能力較VC低，但明顯高于BHT，是BHT的20.5倍。

綜上所述，黑莓果實具有一定的清除自由基活性，清除效果與其濃度存在明顯的量效關(guān)系。過量的自由基是人體多種疾病(如腫瘤、炎癥、衰老和血液病)的元兇［20］，因此黑莓果實不僅可以作為一種保健食療的水果，以黑莓果實為原料提取的色素清除自由基的活性也遠高于人工合成的抗氧化劑BHT，可以同VC媲美，具有進一步開發(fā)利用的價值。

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