張 睿，陶建敏，蔡斌華，章 鎮(zhèn)

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095）

基因的表達有著嚴格的時間及空間順序。開花誘導(dǎo)調(diào)控普遍存在于高等植物中，當植物生長到一定時期后，在外界適宜環(huán)境條件的誘導(dǎo)下啟動自身發(fā)育程序，由營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)入生殖生長。FT（FLOWERING LOCUS T）、AP3（APETALLA3）、AG（AGAMOUS）和FLC（FLOWERING LOCUSC）是調(diào)控成花時間及花器官原基分化與發(fā)育的關(guān)鍵基因。FT基因為重要的成花轉(zhuǎn)變信號，是多個成花途徑的交匯作用基因［1］，F(xiàn)T與SOC1（SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1）基因的表達均可被光周期途徑正向調(diào)控，且FT可通過CO（CONSTANS）基因調(diào)節(jié)SOC1的表達［2］。FLC基因是調(diào)控春化作用需求和響應(yīng)的關(guān)鍵基因之一，是具有抑制成花轉(zhuǎn)變作用的MADS-box轉(zhuǎn)錄因子［3］，可直接阻遏FT和SOC1的表達［4］，且FLC的表達與多種正負調(diào)節(jié)因子緊密相關(guān)；春化作用可減弱FLC對成花的抑制能力，F(xiàn)RI（FRIGIDA）及FRI類似基因均可增強FLC的抑制作用［5］；FLC的作用部分依賴于另一 MADS蛋白 SVP（SHORT VEGETATIVE PHASE）［6］，自主途徑也可通過下調(diào)FLC基因表達促進成花［7］。AP3基因在啟動花瓣和雄蕊發(fā)育程序中有著B類基因的功能，并在花的第2輪和第3輪器官發(fā)育中表達。AG基因在雄蕊和心皮的發(fā)育中起C類基因的作用［8］，可能在花發(fā)育后期表達，并直接調(diào)控細胞內(nèi)特異基因的表達。

啟動子（promoter）是一段提供RNA聚合酶特異識別和結(jié)合位點的DNA序列，可控制基因轉(zhuǎn)錄的起始時間和表達程度，通常位于基因轉(zhuǎn)錄起始位點近端的核苷酸序列上游區(qū)域內(nèi)，主要由核心啟動區(qū)、上游元件和應(yīng)答元件組成［9］。啟動子通過選擇性影響目的基因的轉(zhuǎn)錄水平來調(diào)節(jié)基因的表達量，并可限定基因在特定時空條件下的表達，在基因工程中具有廣闊的應(yīng)用前景。

基于熱不對稱交錯式 PCR的基因組步移法（SEFA-PCR，self-formed adaptor PCR）具有高效經(jīng)濟的特點，僅需2條特異的巢式引物和1條部分隨機引物即可進行PCR擴增；其特殊的熱循環(huán)程序有利于特異產(chǎn)物的擴增，并抑制隨機引物產(chǎn)生的非特異產(chǎn)物。此方法由Wang等［10］通過對TAIL-PCR技術(shù)［11］的改良而產(chǎn)生，具有較高的靈敏度和特異性，在高等植物的相關(guān)研究中已有應(yīng)用這一技術(shù)克隆啟動子的報道。楊國棟［12］利用 TAIL-PCR技術(shù)，從棉花（Gossypium spp.）基因組中克隆到長度為1610 bp的 GhNHX1基因啟動子片段；李娜等［13］采用SEFA-PCR法克隆獲得靈芝鱉烯合酶基因啟動子；歐陽翔等［14］通過SEFA-PCR方法，擴增得到靈芝漆酶基因起始密碼子上游長832 bp的啟動子序列，該啟動子區(qū)域除分布有基本的轉(zhuǎn)錄起始元件外，還存在多個潛在的順式作用元件序列位點。SEFA-PCR反應(yīng)對DNA模板質(zhì)量要求不高，適宜的熱循環(huán)程序是其獲得特異目標產(chǎn)物的關(guān)鍵。采用該方法擴增獲得的片段長度通常大于2 kb，是一種有效的啟動子克隆手段。

目前，葡萄（Vitis vinifera L.）中FT、FLC、AP3和AG基因已被克隆，但關(guān)于這4個基因啟動子克隆及功能分析的報道尚不多見。作者采用SEFA-PCR法，從藤稔葡萄（V.vinifera×V.labrusca‘Fujiminori’）基因組中克隆這4個基因的啟動子序列，并對FT、FLC和AP3啟動子進行序列分析和順式調(diào)控作用元件及功能預(yù)測，以期為進一步深入研究這些基因的表達調(diào)控模式提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試的藤稔葡萄新鮮幼嫩葉片采自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)滄波門實驗基地。

LA Taq DNA聚合酶、10×LA buffer、MgCl2、d NTPs mixture、pMD19-T載體連接試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；Axyprep1 kb DNA marker及Axyprep DNA凝膠回收試劑盒購自愛思進生物技術(shù)（杭州）有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α為本實驗室保存的菌株；PCR引物合成及PCR產(chǎn)物測序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

所用儀器有DYY-6C型瓊脂糖凝膠電泳儀（北京市六一儀器廠）、BioPhotometer plus核酸蛋白測定儀（德國Eppendorf公司）、凝膠成像系統(tǒng)FR-200紫外與可見分析裝置（上海復(fù)日科技有限公司）和BIORAD mylyder梯度PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 基因組總DNA的提取及檢測方法 采用改良CTAB法［15］提取基因組總DNA，實際操作過程略有改動。取約200 mg樣葉，于液氮中研成粉末，加入1 mL65℃預(yù)熱的提取緩沖液〔含1.4 mol·L-1NaCl、0.1 mol·L-1Tris-HCl緩沖液（pH8.0）、質(zhì)量體積分數(shù)2％CTAB和20mmol·L-1EDTA，使用前加入體積分數(shù)2％ β-巰基乙醇〕，混勻后于65℃水浴保溫50 min，期間上下輕輕顛倒2～3次，4℃、12000 r·min-1離心10 min；上清液加入等體積三氯甲烷，充分混合后于4℃、12000 r·min-1離心10 min；上清液加入等體積V（苯酚）∶V（三氯甲烷）=1∶1的混合液，充分混合，于4℃、12000 r·min-1離心10 min；上清液加入0.8倍體積三氯甲烷抽提1次，于4℃、12000 r·min-1離心10 min；向上清液中加入1/10體積的3 mol·L-1乙酸鈉（pH5.2）和2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混合均勻后置于-20℃冰箱中靜置30 min沉淀DNA，于4℃、12000 r·min-1離心10 min，棄上清液；用體積分數(shù)75％乙醇洗滌沉淀3次，將沉淀干燥后加入30μL雙蒸水，溶解后即為總DNA溶液。

取2μL總DNA溶液，用含有溴化乙錠（EB）的質(zhì)量體積分數(shù)1％的非變性瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。取1μL總DNA溶液，加入49μL雙蒸水，用核酸蛋白測定儀檢測DNA純度。

1.2.2 引物設(shè)計和PCR擴增條件 根據(jù)本實驗室克隆獲得的藤稔葡萄FT、FLC、AP3及AG基因cDNA序列（GenBank登錄號分別為 HM192810、HM192809、HM192808和HM192807），參照Wang等［10］的方法為每個基因設(shè)計2條巢式引物和1條部分隨機引物，引物名稱及序列詳見表1。

表1 用于藤稔葡萄花發(fā)育相關(guān)基因啟動子克隆的引物序列Table1 Primer sequences used for cloning of promoters of flower development related genes of Vitis vinifera×V.labrusca‘Fujim inori’

參照文獻［10］采用SEFA-PCR法進行PCR擴增，2輪反應(yīng)體系的總體積均為30μL。

第1輪PCR反應(yīng)體系包括10×LA buffer3μL、0.25 mol·L-1MgCl23μL、0.25 mol·L-1d NTPs mixture5μL、5 U·μL-1LA Taq DNA聚合酶0.3μL、DNA模板1.5μL（約1μg）和10μmol·L-1引物SP30.5μL，用雙蒸水補足至30μL。反應(yīng)程序為：94℃90 s、30℃3 min；以0.2℃·s-1的速率緩慢升溫至70℃，保持5 min；加入10μmol·L-1引物SP11.5 μL，繼續(xù)進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序為94℃30 s、70℃5.5 min，運行25個循環(huán)；94℃30 s、70℃5 min、94℃30 s、70℃5 min、94℃30 s、55℃30 s、70℃5 min，運行10個循環(huán)。

第2輪PCR反應(yīng)體系包括10×LA buffer3μL、0.25 mol·L-1MgCl23μL、0.25 mol·L-1d NTPs mixture5μL、5 U·μL-1LA Taq DNA聚合酶0.3μL、10μmol·L-1引物SP21.5μL和稀釋10倍的第1輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物1μL，用雙蒸水補足至30μL。擴增反應(yīng)程序為94℃30 s、68℃5.5 min，運行30個循環(huán)；94℃30 s、70℃5 min、94℃30 s、70℃5 min、94℃30 s、66℃30 s、70℃5 min，運行10個循環(huán)；94℃30 s、70℃5 min、94℃30 s、70℃5 min、94℃30 s、55℃30 s、70℃5 min，運行10個循環(huán)。

1.2.3 目的基因片段的回收及克隆 用含有EB的質(zhì)量體積分數(shù)1％的非變性瓊脂糖凝膠對擴增產(chǎn)物進行電泳，切下目的基因片段，按Axyprep DNA凝膠回收試劑盒的操作說明回收DNA。將目的基因片段與pMD19-T載體連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，經(jīng)Amp篩選，隨機挑選PCR陽性克隆進行測序。

1.3 序列分析

將獲得的核酸序列在NCBI（http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov）上用 BLASTn進行序列相似性分析。應(yīng)用在線植物轉(zhuǎn)錄元件分析工具PlantCARE對獲得的啟動子序列進行分析，尋找轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點（TFBS，transcription factor binding site）。

2 結(jié)果和分析

2.1 SEFA－PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果分析

采用SEFA-PCR方法獲得的藤稔葡萄基因組總DNA第1輪和第2輪PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳圖譜見圖1。由圖1-a可見：除AG基因沒有擴增出明顯條帶外，其他3個基因均擴增出特異條帶，有的甚至還有多條帶。由圖1-b可見：AP3、FT和FLC3個基因均擴增出單一且特異的目的條帶，且長度均大于1000 bp；AG基因也能擴增出條帶，但條帶呈彌散狀，沒有特異條帶，因而無法回收用于序列分析及順式調(diào)控作用元件預(yù)測。

圖1 藤稔葡萄花發(fā)育相關(guān)基因啟動子SEFA－PCR第1輪和第2輪擴增產(chǎn)物的電泳圖譜Fig.1 Electrophoretogram of the first and the second round amplification products of SEFA-PCR of promoters of flower development related gene of Vitis vinifera×V.labrusca‘Fujim inori’

2.2 序列分析及順式調(diào)控作用元件和功能預(yù)測結(jié)果

藤稔葡萄3個花發(fā)育相關(guān)基因FT、FLC和AP3的啟動子序列的GenBank登錄號分別為HM192806、HM192805和HM192804，且均包含多種具有不同功能的順式調(diào)控作用元件。

FT片段長1605 bp，包含基因區(qū)域135 bp和實際啟動子區(qū)域1470 bp，其中，F(xiàn)T啟動子區(qū)序列與葡萄基因組序列（AM459941）的相似性為97％。經(jīng)PlantCARE在線預(yù)測的FT啟動子區(qū)順式調(diào)控作用元件及功能見表2。FT啟動子區(qū)片段包含參與茉莉酸甲酯響應(yīng)的順式調(diào)控作用元件、真菌刺激響應(yīng)元件、參與玉米蛋白代謝調(diào)控的順式調(diào)控作用元件、參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點、參與植物生長素響應(yīng)的順式調(diào)控作用元件、參與胚乳表達的順式調(diào)控作用元件以及與花分生組織特定激活有關(guān)的順式調(diào)控作用元件及多個光響應(yīng)元件等，說明藤稔葡萄FT基因的表達可能受茉莉酸甲酯、玉米蛋白代謝、MYB、植物生長素、真菌刺激、干旱和光調(diào)控，并可能在花的分生組織和胚乳中表達。

FLC片段長1788 bp，包含基因區(qū)域90 bp和實際啟動子區(qū)域1698 bp，其中，F(xiàn)LC啟動子區(qū)序列與葡萄基因組序列（AM444662.2）的相似性為96％。經(jīng)PlantCARE在線預(yù)測的FLC啟動子區(qū)順式調(diào)控作用元件及功能見表3。FLC啟動子區(qū)片段包含參與茉莉酸甲酯響應(yīng)的順式調(diào)控作用元件、參與脫落酸和VP1響應(yīng)的順式作用元件、厭氧誘導(dǎo)必需的順式調(diào)控作用元件、MYB結(jié)合位點、真菌刺激響應(yīng)元件、參與晝夜節(jié)律控制的順式調(diào)控作用元件、光響應(yīng)元件及與花分生組織表達有關(guān)的順式調(diào)控作用元件等，說明藤稔葡萄FLC基因的表達可能受茉莉酸甲酯、脫落酸、MYB、VP1、厭氧誘導(dǎo)、晝夜節(jié)律、真菌刺激和光調(diào)控，并可能在花的分生組織中表達。

AP3片段長1143 bp，包含基因區(qū)域82 bp和實際啟動子區(qū)域1061 bp，其中，AP3啟動子區(qū)序列與葡萄基因組序列（AM469149.1）的相似性為100％。經(jīng)PlantCARE在線預(yù)測的AP3啟動子區(qū)順式調(diào)控作用元件及功能見表4。AP3啟動子區(qū)片段包含赤霉素響應(yīng)元件、真菌刺激響應(yīng)元件、參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點、參與脫落酸響應(yīng)的順式作用元件、參與水楊酸響應(yīng)的順式作用元件、MYBHv1結(jié)合位點、光響應(yīng)元件、胚乳表達所需的順式調(diào)控作用元件及與花分生組織特定激活有關(guān)的順式調(diào)控作用元件等，說明藤稔葡萄AP3基因的表達可能受赤霉素、真菌刺激、脫落酸、水楊酸、MYB、MYBHv1、干旱誘導(dǎo)和光調(diào)控，并可能在花的分生組織及胚乳中表達。

表2 應(yīng)用PlantCARE在線預(yù)測的藤稔葡萄花發(fā)育相關(guān)基因FT啟動子區(qū)的順式調(diào)控作用元件及功能Table2 The cis-acting regulatory elements and functions of promoter region in flower development related gene FT of Vitis vinifera×V.labrusca‘Fujim inori’by PlantCARE on-line prediction

表3 應(yīng)用PlantCARE在線預(yù)測的藤稔葡萄花發(fā)育相關(guān)基因FLC啟動子區(qū)的順式調(diào)控作用元件及功能Table3 The cis-acting regulatory elements and functions of promoter region in flower development related gene FLC of Vitis vinifera×V.labrusca‘Fujim inori’by PlantCARE on-line prediction

續(xù)表3 Table3（Continued）

表4 應(yīng)用PlantCARE在線預(yù)測的藤稔葡萄花發(fā)育相關(guān)基因AP3啟動子區(qū)的順式調(diào)控作用元件及功能Table4 The cis-acting regulatory elementsand functions of promoter region in flower development related gene AP3 of Vitis vinifera×V.labrusca‘Fujim inori’by PlantCARE on-line prediction

3 結(jié) 論

植物成花過程中存在多種成花誘導(dǎo)途徑，在擬南芥〔Arabidopsis thaliana（L.）Heynh.〕等模式植物中FT基因是光周期誘導(dǎo)途徑的核心基因之一［16］。潘才博等［17］推測：菊花〔Dendranthema morifolium（Ramat.） Tzvel.〕的花發(fā)育相關(guān)基因FT主要與光周期敏感性密切相關(guān)，可能在光周期誘導(dǎo)途徑中具有促進開花的作用。Kong等［18］認為：FT的2個同源基因GmFT2a和GmFT5a的表達量在短日照條件下被高度上調(diào)，并誘導(dǎo)大豆〔Glycinemax（L.）Merr.〕開花。

盡管目前沒有證據(jù)表明葡萄存在經(jīng)典的成花途徑（如春化作用和光周期等），但葡萄中仍存在相關(guān)途徑的調(diào)控基因，如FT和FLC等，這些基因在葡萄成花過程中的作用有待深入研究。藤稔葡萄的FT、FLC和AP3基因啟動子序列片段中均存在多種誘導(dǎo)響應(yīng)元件，可能均為誘導(dǎo)型啟動子；3個基因的表達均受光調(diào)控，且均與真菌刺激和MYB相關(guān)。

藤稔葡萄花發(fā)育相關(guān)基因FT、FLC和AP3的啟動子中均含有不同的組織特異表達元件，F(xiàn)T、FLC和AP3均可能在花的分生組織中表達，而FT和AP3還可能在胚乳中表達。Fumie等［19］從Citrus種子中分離出1個FT/TFL1的同源基因CuMFT1，并在成熟種子中檢測到該基因的高量表達，經(jīng)克隆獲得2.4 kb的CuMFT1基因5′端上游片段，通過序列分析和轉(zhuǎn)化擬南芥證實其具有種子特異啟動子活性。本研究結(jié)果在一定程度上印證了這一結(jié)果。

雖然通過對藤稔葡萄花發(fā)育相關(guān)基因啟動子進行序列分析判斷出一些順式調(diào)控作用元件，為最終了解這些基因的表達調(diào)控模式提供了依據(jù)，但若需全面了解這些元件在轉(zhuǎn)錄過程中的調(diào)節(jié)作用，還有待更進一步的深入研究。

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