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        藤稔葡萄花發(fā)育相關(guān)基因啟動(dòng)子的克隆及功能分析

        2011-12-31 13:31:10陶建敏蔡斌華
        關(guān)鍵詞:葡萄花成花元件

        張 睿,陶建敏,蔡斌華,章 鎮(zhèn)

        (南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,江蘇 南京 210095)

        基因的表達(dá)有著嚴(yán)格的時(shí)間及空間順序。開(kāi)花誘導(dǎo)調(diào)控普遍存在于高等植物中,當(dāng)植物生長(zhǎng)到一定時(shí)期后,在外界適宜環(huán)境條件的誘導(dǎo)下啟動(dòng)自身發(fā)育程序,由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)入生殖生長(zhǎng)。FT(FLOWERING LOCUS T)、AP3(APETALLA3)、AG(AGAMOUS)和FLC(FLOWERING LOCUSC)是調(diào)控成花時(shí)間及花器官原基分化與發(fā)育的關(guān)鍵基因。FT基因?yàn)橹匾某苫ㄞD(zhuǎn)變信號(hào),是多個(gè)成花途徑的交匯作用基因[1],F(xiàn)T與SOC1(SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1)基因的表達(dá)均可被光周期途徑正向調(diào)控,且FT可通過(guò)CO(CONSTANS)基因調(diào)節(jié)SOC1的表達(dá)[2]。FLC基因是調(diào)控春化作用需求和響應(yīng)的關(guān)鍵基因之一,是具有抑制成花轉(zhuǎn)變作用的MADS-box轉(zhuǎn)錄因子[3],可直接阻遏FT和SOC1的表達(dá)[4],且FLC的表達(dá)與多種正負(fù)調(diào)節(jié)因子緊密相關(guān);春化作用可減弱FLC對(duì)成花的抑制能力,F(xiàn)RI(FRIGIDA)及FRI類似基因均可增強(qiáng)FLC的抑制作用[5];FLC的作用部分依賴于另一 MADS蛋白 SVP(SHORT VEGETATIVE PHASE)[6],自主途徑也可通過(guò)下調(diào)FLC基因表達(dá)促進(jìn)成花[7]。AP3基因在啟動(dòng)花瓣和雄蕊發(fā)育程序中有著B類基因的功能,并在花的第2輪和第3輪器官發(fā)育中表達(dá)。AG基因在雄蕊和心皮的發(fā)育中起C類基因的作用[8],可能在花發(fā)育后期表達(dá),并直接調(diào)控細(xì)胞內(nèi)特異基因的表達(dá)。

        啟動(dòng)子(promoter)是一段提供RNA聚合酶特異識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)的DNA序列,可控制基因轉(zhuǎn)錄的起始時(shí)間和表達(dá)程度,通常位于基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)近端的核苷酸序列上游區(qū)域內(nèi),主要由核心啟動(dòng)區(qū)、上游元件和應(yīng)答元件組成[9]。啟動(dòng)子通過(guò)選擇性影響目的基因的轉(zhuǎn)錄水平來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)量,并可限定基因在特定時(shí)空條件下的表達(dá),在基因工程中具有廣闊的應(yīng)用前景。

        基于熱不對(duì)稱交錯(cuò)式 PCR的基因組步移法(SEFA-PCR,self-formed adaptor PCR)具有高效經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn),僅需2條特異的巢式引物和1條部分隨機(jī)引物即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增;其特殊的熱循環(huán)程序有利于特異產(chǎn)物的擴(kuò)增,并抑制隨機(jī)引物產(chǎn)生的非特異產(chǎn)物。此方法由Wang等[10]通過(guò)對(duì)TAIL-PCR技術(shù)[11]的改良而產(chǎn)生,具有較高的靈敏度和特異性,在高等植物的相關(guān)研究中已有應(yīng)用這一技術(shù)克隆啟動(dòng)子的報(bào)道。楊國(guó)棟[12]利用 TAIL-PCR技術(shù),從棉花(Gossypium spp.)基因組中克隆到長(zhǎng)度為1610 bp的 GhNHX1基因啟動(dòng)子片段;李娜等[13]采用SEFA-PCR法克隆獲得靈芝鱉烯合酶基因啟動(dòng)子;歐陽(yáng)翔等[14]通過(guò)SEFA-PCR方法,擴(kuò)增得到靈芝漆酶基因起始密碼子上游長(zhǎng)832 bp的啟動(dòng)子序列,該啟動(dòng)子區(qū)域除分布有基本的轉(zhuǎn)錄起始元件外,還存在多個(gè)潛在的順式作用元件序列位點(diǎn)。SEFA-PCR反應(yīng)對(duì)DNA模板質(zhì)量要求不高,適宜的熱循環(huán)程序是其獲得特異目標(biāo)產(chǎn)物的關(guān)鍵。采用該方法擴(kuò)增獲得的片段長(zhǎng)度通常大于2 kb,是一種有效的啟動(dòng)子克隆手段。

        目前,葡萄(Vitis vinifera L.)中FT、FLC、AP3和AG基因已被克隆,但關(guān)于這4個(gè)基因啟動(dòng)子克隆及功能分析的報(bào)道尚不多見(jiàn)。作者采用SEFA-PCR法,從藤稔葡萄(V.vinifera×V.labrusca‘Fujiminori’)基因組中克隆這4個(gè)基因的啟動(dòng)子序列,并對(duì)FT、FLC和AP3啟動(dòng)子進(jìn)行序列分析和順式調(diào)控作用元件及功能預(yù)測(cè),以期為進(jìn)一步深入研究這些基因的表達(dá)調(diào)控模式提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        1 材料和方法

        1.1 材料

        供試的藤稔葡萄新鮮幼嫩葉片采自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)滄波門實(shí)驗(yàn)基地。

        LA Taq DNA聚合酶、10×LA buffer、MgCl2、d NTPs mixture、pMD19-T載體連接試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;Axyprep1 kb DNA marker及Axyprep DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司;大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存的菌株;PCR引物合成及PCR產(chǎn)物測(cè)序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

        所用儀器有DYY-6C型瓊脂糖凝膠電泳儀(北京市六一儀器廠)、BioPhotometer plus核酸蛋白測(cè)定儀(德國(guó)Eppendorf公司)、凝膠成像系統(tǒng)FR-200紫外與可見(jiàn)分析裝置(上海復(fù)日科技有限公司)和BIORAD mylyder梯度PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

        1.2 方法

        1.2.1 基因組總DNA的提取及檢測(cè)方法 采用改良CTAB法[15]提取基因組總DNA,實(shí)際操作過(guò)程略有改動(dòng)。取約200 mg樣葉,于液氮中研成粉末,加入1 mL65℃預(yù)熱的提取緩沖液〔含1.4 mol·L-1NaCl、0.1 mol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH8.0)、質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)2%CTAB和20mmol·L-1EDTA,使用前加入體積分?jǐn)?shù)2% β-巰基乙醇〕,混勻后于65℃水浴保溫50 min,期間上下輕輕顛倒2~3次,4℃、12000 r·min-1離心10 min;上清液加入等體積三氯甲烷,充分混合后于4℃、12000 r·min-1離心10 min;上清液加入等體積V(苯酚)∶V(三氯甲烷)=1∶1的混合液,充分混合,于4℃、12000 r·min-1離心10 min;上清液加入0.8倍體積三氯甲烷抽提1次,于4℃、12000 r·min-1離心10 min;向上清液中加入1/10體積的3 mol·L-1乙酸鈉(pH5.2)和2倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇,混合均勻后置于-20℃冰箱中靜置30 min沉淀DNA,于4℃、12000 r·min-1離心10 min,棄上清液;用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇洗滌沉淀3次,將沉淀干燥后加入30μL雙蒸水,溶解后即為總DNA溶液。

        取2μL總DNA溶液,用含有溴化乙錠(EB)的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1%的非變性瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。取1μL總DNA溶液,加入49μL雙蒸水,用核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)DNA純度。

        1.2.2 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增條件 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室克隆獲得的藤稔葡萄FT、FLC、AP3及AG基因cDNA序列(GenBank登錄號(hào)分別為 HM192810、HM192809、HM192808和HM192807),參照Wang等[10]的方法為每個(gè)基因設(shè)計(jì)2條巢式引物和1條部分隨機(jī)引物,引物名稱及序列詳見(jiàn)表1。

        表1 用于藤稔葡萄花發(fā)育相關(guān)基因啟動(dòng)子克隆的引物序列Table1 Primer sequences used for cloning of promoters of flower development related genes of Vitis vinifera×V.labrusca‘Fujim inori’

        參照文獻(xiàn)[10]采用SEFA-PCR法進(jìn)行PCR擴(kuò)增,2輪反應(yīng)體系的總體積均為30μL。

        第1輪PCR反應(yīng)體系包括10×LA buffer3μL、0.25 mol·L-1MgCl23μL、0.25 mol·L-1d NTPs mixture5μL、5 U·μL-1LA Taq DNA聚合酶0.3μL、DNA模板1.5μL(約1μg)和10μmol·L-1引物SP30.5μL,用雙蒸水補(bǔ)足至30μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃90 s、30℃3 min;以0.2℃·s-1的速率緩慢升溫至70℃,保持5 min;加入10μmol·L-1引物SP11.5 μL,繼續(xù)進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)?4℃30 s、70℃5.5 min,運(yùn)行25個(gè)循環(huán);94℃30 s、70℃5 min、94℃30 s、70℃5 min、94℃30 s、55℃30 s、70℃5 min,運(yùn)行10個(gè)循環(huán)。

        第2輪PCR反應(yīng)體系包括10×LA buffer3μL、0.25 mol·L-1MgCl23μL、0.25 mol·L-1d NTPs mixture5μL、5 U·μL-1LA Taq DNA聚合酶0.3μL、10μmol·L-1引物SP21.5μL和稀釋10倍的第1輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物1μL,用雙蒸水補(bǔ)足至30μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4℃30 s、68℃5.5 min,運(yùn)行30個(gè)循環(huán);94℃30 s、70℃5 min、94℃30 s、70℃5 min、94℃30 s、66℃30 s、70℃5 min,運(yùn)行10個(gè)循環(huán);94℃30 s、70℃5 min、94℃30 s、70℃5 min、94℃30 s、55℃30 s、70℃5 min,運(yùn)行10個(gè)循環(huán)。

        1.2.3 目的基因片段的回收及克隆 用含有EB的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1%的非變性瓊脂糖凝膠對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳,切下目的基因片段,按Axyprep DNA凝膠回收試劑盒的操作說(shuō)明回收DNA。將目的基因片段與pMD19-T載體連接,并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中,經(jīng)Amp篩選,隨機(jī)挑選PCR陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

        1.3 序列分析

        將獲得的核酸序列在NCBI(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)上用 BLASTn進(jìn)行序列相似性分析。應(yīng)用在線植物轉(zhuǎn)錄元件分析工具PlantCARE對(duì)獲得的啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析,尋找轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(TFBS,transcription factor binding site)。

        2 結(jié)果和分析

        2.1 SEFA-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果分析

        采用SEFA-PCR方法獲得的藤稔葡萄基因組總DNA第1輪和第2輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖譜見(jiàn)圖1。由圖1-a可見(jiàn):除AG基因沒(méi)有擴(kuò)增出明顯條帶外,其他3個(gè)基因均擴(kuò)增出特異條帶,有的甚至還有多條帶。由圖1-b可見(jiàn):AP3、FT和FLC3個(gè)基因均擴(kuò)增出單一且特異的目的條帶,且長(zhǎng)度均大于1000 bp;AG基因也能擴(kuò)增出條帶,但條帶呈彌散狀,沒(méi)有特異條帶,因而無(wú)法回收用于序列分析及順式調(diào)控作用元件預(yù)測(cè)。

        圖1 藤稔葡萄花發(fā)育相關(guān)基因啟動(dòng)子SEFA-PCR第1輪和第2輪擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜Fig.1 Electrophoretogram of the first and the second round amplification products of SEFA-PCR of promoters of flower development related gene of Vitis vinifera×V.labrusca‘Fujim inori’

        2.2 序列分析及順式調(diào)控作用元件和功能預(yù)測(cè)結(jié)果

        藤稔葡萄3個(gè)花發(fā)育相關(guān)基因FT、FLC和AP3的啟動(dòng)子序列的GenBank登錄號(hào)分別為HM192806、HM192805和HM192804,且均包含多種具有不同功能的順式調(diào)控作用元件。

        FT片段長(zhǎng)1605 bp,包含基因區(qū)域135 bp和實(shí)際啟動(dòng)子區(qū)域1470 bp,其中,F(xiàn)T啟動(dòng)子區(qū)序列與葡萄基因組序列(AM459941)的相似性為97%。經(jīng)PlantCARE在線預(yù)測(cè)的FT啟動(dòng)子區(qū)順式調(diào)控作用元件及功能見(jiàn)表2。FT啟動(dòng)子區(qū)片段包含參與茉莉酸甲酯響應(yīng)的順式調(diào)控作用元件、真菌刺激響應(yīng)元件、參與玉米蛋白代謝調(diào)控的順式調(diào)控作用元件、參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)、參與植物生長(zhǎng)素響應(yīng)的順式調(diào)控作用元件、參與胚乳表達(dá)的順式調(diào)控作用元件以及與花分生組織特定激活有關(guān)的順式調(diào)控作用元件及多個(gè)光響應(yīng)元件等,說(shuō)明藤稔葡萄FT基因的表達(dá)可能受茉莉酸甲酯、玉米蛋白代謝、MYB、植物生長(zhǎng)素、真菌刺激、干旱和光調(diào)控,并可能在花的分生組織和胚乳中表達(dá)。

        FLC片段長(zhǎng)1788 bp,包含基因區(qū)域90 bp和實(shí)際啟動(dòng)子區(qū)域1698 bp,其中,F(xiàn)LC啟動(dòng)子區(qū)序列與葡萄基因組序列(AM444662.2)的相似性為96%。經(jīng)PlantCARE在線預(yù)測(cè)的FLC啟動(dòng)子區(qū)順式調(diào)控作用元件及功能見(jiàn)表3。FLC啟動(dòng)子區(qū)片段包含參與茉莉酸甲酯響應(yīng)的順式調(diào)控作用元件、參與脫落酸和VP1響應(yīng)的順式作用元件、厭氧誘導(dǎo)必需的順式調(diào)控作用元件、MYB結(jié)合位點(diǎn)、真菌刺激響應(yīng)元件、參與晝夜節(jié)律控制的順式調(diào)控作用元件、光響應(yīng)元件及與花分生組織表達(dá)有關(guān)的順式調(diào)控作用元件等,說(shuō)明藤稔葡萄FLC基因的表達(dá)可能受茉莉酸甲酯、脫落酸、MYB、VP1、厭氧誘導(dǎo)、晝夜節(jié)律、真菌刺激和光調(diào)控,并可能在花的分生組織中表達(dá)。

        AP3片段長(zhǎng)1143 bp,包含基因區(qū)域82 bp和實(shí)際啟動(dòng)子區(qū)域1061 bp,其中,AP3啟動(dòng)子區(qū)序列與葡萄基因組序列(AM469149.1)的相似性為100%。經(jīng)PlantCARE在線預(yù)測(cè)的AP3啟動(dòng)子區(qū)順式調(diào)控作用元件及功能見(jiàn)表4。AP3啟動(dòng)子區(qū)片段包含赤霉素響應(yīng)元件、真菌刺激響應(yīng)元件、參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)、參與脫落酸響應(yīng)的順式作用元件、參與水楊酸響應(yīng)的順式作用元件、MYBHv1結(jié)合位點(diǎn)、光響應(yīng)元件、胚乳表達(dá)所需的順式調(diào)控作用元件及與花分生組織特定激活有關(guān)的順式調(diào)控作用元件等,說(shuō)明藤稔葡萄AP3基因的表達(dá)可能受赤霉素、真菌刺激、脫落酸、水楊酸、MYB、MYBHv1、干旱誘導(dǎo)和光調(diào)控,并可能在花的分生組織及胚乳中表達(dá)。

        表2 應(yīng)用PlantCARE在線預(yù)測(cè)的藤稔葡萄花發(fā)育相關(guān)基因FT啟動(dòng)子區(qū)的順式調(diào)控作用元件及功能Table2 The cis-acting regulatory elements and functions of promoter region in flower development related gene FT of Vitis vinifera×V.labrusca‘Fujim inori’by PlantCARE on-line prediction

        表3 應(yīng)用PlantCARE在線預(yù)測(cè)的藤稔葡萄花發(fā)育相關(guān)基因FLC啟動(dòng)子區(qū)的順式調(diào)控作用元件及功能Table3 The cis-acting regulatory elements and functions of promoter region in flower development related gene FLC of Vitis vinifera×V.labrusca‘Fujim inori’by PlantCARE on-line prediction

        續(xù)表3 Table3(Continued)

        表4 應(yīng)用PlantCARE在線預(yù)測(cè)的藤稔葡萄花發(fā)育相關(guān)基因AP3啟動(dòng)子區(qū)的順式調(diào)控作用元件及功能Table4 The cis-acting regulatory elementsand functions of promoter region in flower development related gene AP3 of Vitis vinifera×V.labrusca‘Fujim inori’by PlantCARE on-line prediction

        3 結(jié) 論

        植物成花過(guò)程中存在多種成花誘導(dǎo)途徑,在擬南芥〔Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.〕等模式植物中FT基因是光周期誘導(dǎo)途徑的核心基因之一[16]。潘才博等[17]推測(cè):菊花〔Dendranthema morifolium(Ramat.) Tzvel.〕的花發(fā)育相關(guān)基因FT主要與光周期敏感性密切相關(guān),可能在光周期誘導(dǎo)途徑中具有促進(jìn)開(kāi)花的作用。Kong等[18]認(rèn)為:FT的2個(gè)同源基因GmFT2a和GmFT5a的表達(dá)量在短日照條件下被高度上調(diào),并誘導(dǎo)大豆〔Glycinemax(L.)Merr.〕開(kāi)花。

        盡管目前沒(méi)有證據(jù)表明葡萄存在經(jīng)典的成花途徑(如春化作用和光周期等),但葡萄中仍存在相關(guān)途徑的調(diào)控基因,如FT和FLC等,這些基因在葡萄成花過(guò)程中的作用有待深入研究。藤稔葡萄的FT、FLC和AP3基因啟動(dòng)子序列片段中均存在多種誘導(dǎo)響應(yīng)元件,可能均為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子;3個(gè)基因的表達(dá)均受光調(diào)控,且均與真菌刺激和MYB相關(guān)。

        藤稔葡萄花發(fā)育相關(guān)基因FT、FLC和AP3的啟動(dòng)子中均含有不同的組織特異表達(dá)元件,F(xiàn)T、FLC和AP3均可能在花的分生組織中表達(dá),而FT和AP3還可能在胚乳中表達(dá)。Fumie等[19]從Citrus種子中分離出1個(gè)FT/TFL1的同源基因CuMFT1,并在成熟種子中檢測(cè)到該基因的高量表達(dá),經(jīng)克隆獲得2.4 kb的CuMFT1基因5′端上游片段,通過(guò)序列分析和轉(zhuǎn)化擬南芥證實(shí)其具有種子特異啟動(dòng)子活性。本研究結(jié)果在一定程度上印證了這一結(jié)果。

        雖然通過(guò)對(duì)藤稔葡萄花發(fā)育相關(guān)基因啟動(dòng)子進(jìn)行序列分析判斷出一些順式調(diào)控作用元件,為最終了解這些基因的表達(dá)調(diào)控模式提供了依據(jù),但若需全面了解這些元件在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的調(diào)節(jié)作用,還有待更進(jìn)一步的深入研究。

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