毛芝娟，楊季芳，王晶，黃桔玨

（浙江萬(wàn)里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100）

自黑鯛腸道分離一株發(fā)光細(xì)菌的種類鑒定及其發(fā)光特性的研究

毛芝娟，楊季芳，王晶，黃桔玨

（浙江萬(wàn)里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100）

從浙江省象山港網(wǎng)箱養(yǎng)殖黑鯛（Sparus macrocephlus）腸道分離到一株發(fā)光細(xì)菌LB01，經(jīng)過(guò)形態(tài)觀察、生理生化特性測(cè)試和16S rRNA基因序列分析，確定這株菌屬于鰒發(fā)光桿菌（Photobacteria leiognathi）。同時(shí)對(duì)這株菌的發(fā)光條件和發(fā)光特點(diǎn)進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明，LB01在470 nm左右出現(xiàn)最大發(fā)射波長(zhǎng)，在pH值 5.0～6.0，溫度20℃左右，NaCl濃度3%左右等條件下發(fā)光最強(qiáng)。

鰒發(fā)光桿菌；鑒定；發(fā)光特性

發(fā)光細(xì)菌是一類在正常的生理?xiàng)l件下能夠發(fā)射在黑暗處肉眼可見(jiàn)熒光的異養(yǎng)細(xì)菌[1]。目前，全世界已發(fā)現(xiàn)和命名的發(fā)光細(xì)菌有11種[2,3]，分別屬于異短桿菌屬（Xenorhabdus）、發(fā)光桿菌屬（Photobacterium）、希瓦氏菌屬（Shewanella）和弧菌屬（Vibrio）。不同種類發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光機(jī)理相同，由分子氧作用，胞內(nèi)熒光酶催化，將還原態(tài)的黃素單核苷酸（FMNH2）及長(zhǎng)鏈脂肪醛氧化為FMN 及長(zhǎng)鏈脂肪酸，同時(shí)釋放出最大發(fā)光強(qiáng)度在波長(zhǎng)為450～490 nm處的藍(lán)綠光。

發(fā)光細(xì)菌在一定的實(shí)驗(yàn)條件下發(fā)光強(qiáng)度是恒定的，但與外來(lái)受試物接觸后，由于毒物具有抑制發(fā)光的作用，發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度即有所改變，發(fā)光強(qiáng)度的變化可以用生物毒性發(fā)光測(cè)定儀測(cè)出。目前，發(fā)光細(xì)菌生物測(cè)試法已經(jīng)在環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品安全檢測(cè)、醫(yī)學(xué)衛(wèi)生等領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用[4-7]。發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)有毒物質(zhì)具有費(fèi)時(shí)較少且敏感性較好、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

本研究自象山港網(wǎng)箱養(yǎng)殖黑鯛（Sparus macrocephlus）腸道內(nèi)分離到一株發(fā)光細(xì)菌，對(duì)這株菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性測(cè)試和分子生物學(xué)鑒定，并對(duì)其生長(zhǎng)條件及發(fā)光特性進(jìn)行了初步研究，旨在為該菌在生物傳感器中可能的應(yīng)用提供部分基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基的種類和配方 實(shí)驗(yàn)中用到海水2216E培養(yǎng)基、發(fā)光固體培養(yǎng)基、發(fā)光液體培養(yǎng)基、LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基和TCBS培養(yǎng)基。

海水 2216E培養(yǎng)基配方如下：蛋白胨5 g，酵母粉1 g，磷酸鐵0.01 g，加陳海水1 000 mL，調(diào)pH值 7.6，121℃，滅菌20 min。固體培養(yǎng)基則加入1.6 %的瓊脂粉。

發(fā)光固體培養(yǎng)基和發(fā)光液體培養(yǎng)基參照杜宗軍等[8]的配方。

LB培養(yǎng)基配方如下：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 5 g（固體培養(yǎng)基加瓊脂粉 16 g），加蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH值 7.2～7.4，121℃，滅菌20 min。

TCBS培養(yǎng)基采用杭州天和微生物試劑有限公司的成品培養(yǎng)基TCBS瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)光菌株的分離 以無(wú)菌方法取出一健康黑鯛（重 150 g，取自浙江省象山港養(yǎng)殖網(wǎng)箱）的腸道內(nèi)容物，以無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋，取稀釋液涂布海水 2216E平板和發(fā)光固體平板，28℃，黑暗條件下培養(yǎng)，觀察發(fā)光菌落的出現(xiàn)情況。24 h后出現(xiàn)發(fā)光菌落，轉(zhuǎn)接，分離，得到穩(wěn)定發(fā)光的菌株LB01。

1.2.2 發(fā)光菌株的形態(tài)和理化特性鑒定 對(duì)分離的發(fā)光細(xì)菌菌株進(jìn)行形態(tài)和生理生化特征測(cè)定，測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[9,10]，微量生化反應(yīng)管購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2.3 發(fā)光菌株的16S rDNA序列的PCR及序列同源性分析 選用細(xì)菌通用16S rRNA引物[11]，序列為 p1：5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’，p2：5’GGTTACCTTGTTACGACTT 3’，以發(fā)光細(xì)菌基因組DNA為模板，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃，初始變性 4 min，94℃，變性 30 s，55℃，退火 45 s，72℃，延伸90 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后，72℃終延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后純化回收，送交英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測(cè)序，所得序列經(jīng)BlastN比對(duì)后以MEGA 4.0采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)行同源性分析。

1.2.4 發(fā)光特性的檢測(cè)

1.2.4.1 發(fā)光菌株的發(fā)光波長(zhǎng)、發(fā)光強(qiáng)度檢測(cè)檢測(cè)儀器為可見(jiàn)光熒光分光光度計(jì)（Hitachi F－4 500），檢測(cè)發(fā)光波長(zhǎng)時(shí)，掃描波長(zhǎng)范圍為350～600 nm，檢測(cè)相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度 I（a.u）。

1.2.4.2 NaCl濃度對(duì)菌株發(fā)光的影響 配制濃度分別為 0、1%、2%、3%、5%、7.5%和 10%的NaC1緩沖液；挑 LB01單菌落接入 5 mL 海水2216E液體培養(yǎng)基中，30℃ 振蕩培養(yǎng)5 h，取 LB01菌培養(yǎng)液100 μL，加入到0.9 mL不同濃度的NaC1鹽水緩沖液中，測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度。

1.2.4.3 PH 值對(duì)菌株發(fā)光的影響 取 100 μL LB01培養(yǎng)液接入0.9 mL pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0含3%NaC1的緩沖液中，測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度。

1.2.4.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株發(fā)光的影響 取 LB01培養(yǎng)液100 μL轉(zhuǎn)接入25 mL海水2216E液體培養(yǎng)基，28℃恒溫，暗處培養(yǎng) 3～48 h，定期用肉眼觀察記錄發(fā)光情況。

1.2.4.5 溫度對(duì)菌株發(fā)光的影響 取 100 μL LB01培養(yǎng)液，加入到0.9 mL溫度分別為4℃、20℃、30℃、35℃、40℃的3%NaC1緩沖液中，測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度。

1.2.4.6 細(xì)菌密度對(duì)發(fā)光的影響 取5、10、20、50、100、200 μL LB01 培養(yǎng)液，分別加入到 5 mL 3%的NaC1緩沖液中，測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度和OD600值。

2 結(jié) 果

2.1 LB01的形態(tài)學(xué)和理化特性鑒定

通過(guò)2216E平板和發(fā)光平板培養(yǎng)觀察，自黑鯛腸道內(nèi)容物中分離得到一株發(fā)光細(xì)菌，命名為L(zhǎng)B01。該菌株在 2216E固體培養(yǎng)基上的菌落為圓形，乳白色，不透明，表面濕潤(rùn)，邊緣整齊，黑暗處發(fā)出藍(lán)綠色熒光。在TCBS培養(yǎng)基上的菌落為綠色，呈擴(kuò)散狀生長(zhǎng)，不發(fā)光。革蘭氏染色陰性，菌體呈桿狀。

以微量生化管法對(duì)LB01菌株的主要理化特性進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1。該菌4℃生長(zhǎng)，對(duì)O/129（150 μg/mL）不敏感，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，氧化酶、過(guò)氧化氫酶、精氨酸雙水解酶、硝酸鹽降解陽(yáng)性；不產(chǎn)生脂酶、淀粉酶和脂肪酶；生長(zhǎng)需鈉；能發(fā)酵乙酸鹽、纖維二糖、半乳糖、甘露糖等碳水化合物作為單一碳源。除 4℃生長(zhǎng)、賴氨酸脫羧反應(yīng)陽(yáng)性、8% NaCl胨水中生長(zhǎng)、發(fā)酵利用纖維二糖等幾項(xiàng)外，與鰒發(fā)光桿菌（Photobacterium leiognathi）[12]的特性最為接近。對(duì)照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第八版）[9]，該菌株可以初步鑒定為發(fā)光桿屬中的鰒發(fā)光桿菌。

表1 菌株LB01的形態(tài)和理化特性Tab. 1 Morphological, physical and biochemical characteristics of strain LB01

2.2 LB01的分子生物學(xué)鑒定

采用細(xì)菌16S rDNA通過(guò)引物，以LB01基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR，獲得了特異性的目的片段，長(zhǎng)約1 500 bp（圖1）。PCR產(chǎn)物直接測(cè)序后獲得1 419 bp的序列，BlastN比對(duì)結(jié)果表明，該序列與數(shù)種發(fā)光細(xì)菌包括鰒發(fā)光桿菌、P. kishitanii、明亮發(fā)光桿菌和P.iliopiscarium等相應(yīng)序列的相似性均在99%以上，其中與鰒發(fā)光桿菌（基因登錄號(hào)：AY292947）16S rRNA基因序列100%同源。選取同源性最高的序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育圖（圖 2），圖中可以看出，LB01株16S r RNA基因與發(fā)光桿菌P.leiognathi聚為一類，與 P. kishitanii、P.phosphoreum等高度相似性序列（99%以上）則聚為一大類，而與P.iliopiscarium（AY849430）距離稍遠(yuǎn)，成為兩個(gè)分枝。

結(jié)合理化特性鑒定的結(jié)果，LB01菌株可以鑒定為鰒發(fā)光桿菌。

圖1 LB01 16S rRNA基因的PCRFig. 1 PCR amplifying of 16S rRNA gene of strain LB01 1：LB01 16S rRNA基因的PCR產(chǎn)物； Marker：DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)

2.3 LB01的發(fā)光特性

對(duì)LB01菌株的發(fā)光特性展開(kāi)了初步的研究，結(jié)果見(jiàn)表2－3和圖3－7。從圖中可以看出，LB01的最大發(fā)光波長(zhǎng)在470 nm左右；在pH值6.0，溫度20℃，NaCl濃度為3.0%左右時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度最高。LB01菌株正常發(fā)光的溫度范圍在15～25℃，pH值范圍在5.0～7.5，適應(yīng)范圍較廣。該菌株在細(xì)胞密度達(dá)到一定值（如OD600值=0.09）后，發(fā)光強(qiáng)度迅速增強(qiáng)；液體培養(yǎng)4 h開(kāi)始發(fā)光，培養(yǎng)7 h左右時(shí)，發(fā)光達(dá)到峰值，持續(xù)發(fā)光時(shí)間長(zhǎng)，可達(dá)26 h。

圖2 LB01 16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 2 Phylogenic tree of 16S rDNA of strain LB01

圖3 LB01菌株的掃描波長(zhǎng)與相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度Fig. 3 Scanning wavelength and the relative luminescence strength of strain LB01

圖4 PH值與LB01發(fā)光強(qiáng)度的關(guān)系Fig. 4 Effects on the luminescence of LB01 by the pH value

圖5 溫度與LB01發(fā)光強(qiáng)度的關(guān)系Fig. 5 Effects on the luminescence of LB01 by temperature

圖6 鹽度與LB01發(fā)光強(qiáng)度的關(guān)系Fig. 6 Effects on the luminescence of LB01 by salinity

圖7 LB01菌液密度與發(fā)光強(qiáng)度的關(guān)系Fig. 7 Effects on the luminescence of LB01 by the density of bacteria suspension

表2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)發(fā)光的影響Tab. 2 Effects on the luminescence of LB01 by culture time

3 討 論

自黑鯛腸道分離到一株發(fā)光細(xì)菌 LB01，對(duì)其進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性鑒定及16S rRNA基因序列的分析。該菌株為革蘭氏陰性桿菌，具有運(yùn)動(dòng)性，氧化酶和過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性、硝酸鹽降解陽(yáng)性、發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)氣，符合《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[9]對(duì)發(fā)光桿菌屬的描述；其它主要理化特性如下：精氨酸雙水解酶陽(yáng)性，生長(zhǎng)需Na+，4℃生長(zhǎng)，不產(chǎn)生淀粉酶、脂酶和明膠酶；能利用纖維二糖、半乳糖、甘露糖等作為單一碳源；對(duì)照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[9]和相關(guān)文獻(xiàn)[12]，LB01可以初步鑒定為發(fā)光桿菌屬的鰒發(fā)光桿菌。

16S rRNA基因序列比對(duì)結(jié)果表明，LB01與數(shù)種發(fā)光桿菌屬種類的同源性均很高，達(dá)到 99%以上，包括鰒發(fā)光桿菌、P. kishitanii、明亮發(fā)光桿菌和 P. iliopiscarium等。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，LB01與鰒發(fā)光桿菌（AY292947）聚為一類，同源性達(dá)100%。已有研究表明，上述4種發(fā)光桿菌本身在生理生化特性上極為相似，16S rDNA序列同源性也極高，但在部分遺傳特性及宿主特性上存在顯著差異，屬于不同的種[12-15]；其中后三者的理化特性極為相近，P. kishitanii和P. illopiscarium是最近才從明亮發(fā)光桿菌中分離出來(lái)的[13,14]；鰒發(fā)光桿菌和明亮發(fā)光桿菌在數(shù)種理化特性上存在明顯差異，前者氧化酶反應(yīng)陽(yáng)性，發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)氣；而后者氧化酶試驗(yàn)陰性，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣[9,13]。分析比較LB01與鰒發(fā)光桿菌和明亮發(fā)光桿菌的理化特性，LB01更接近于鰒發(fā)光桿菌；結(jié)合16S rRNA序列同源性分析，可以判斷為鰒發(fā)光桿菌。

中國(guó)學(xué)者于20世紀(jì)80年代對(duì)國(guó)內(nèi)沿海的發(fā)光細(xì)菌資源進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)了包括鰒發(fā)光桿菌、發(fā)光性哈維氏弧菌（V. harveyi）和費(fèi)氏發(fā)光弧菌(V.fischeri)等主要種類的發(fā)光細(xì)菌，其中鰒發(fā)光桿菌在我國(guó)沿海海域自南到北皆有分布[16-19]。本研究則首次自東海網(wǎng)箱養(yǎng)殖海水魚(yú)—黑鯛腸道內(nèi)分離到一株鰒發(fā)光桿菌，驗(yàn)證了該菌在海水動(dòng)物體內(nèi)的定殖；發(fā)光細(xì)菌在海洋動(dòng)物發(fā)光器官與腸道中的定殖其實(shí)與這些菌種在海水中的分布是對(duì)應(yīng)的[15,20]。

已經(jīng)報(bào)道的海洋發(fā)光細(xì)菌發(fā)射波長(zhǎng)為 450～490 nm[1]，本研究中LB01菌株在培養(yǎng)條件下發(fā)出藍(lán)綠色光，在黑暗條件下肉眼可見(jiàn)，最大發(fā)射波長(zhǎng)在470 nm左右，與已有報(bào)道相符。在pH 值6.0左右，溫度20℃，NaCl濃度3%，發(fā)光最強(qiáng)，與明亮發(fā)光桿菌的發(fā)光條件相近[21,22]；與國(guó)內(nèi)方宏達(dá)等報(bào)道的一株海洋發(fā)光弧菌 D2的發(fā)光條件也比較接近[23]，而與杜宗軍等分離的一株發(fā)光哈維氏弧菌D40發(fā)光條件則略顯差異，后者發(fā)光溫度和pH值范圍更廣一些[8]。鰒發(fā)光桿菌作為一種海洋細(xì)菌，其生長(zhǎng)和發(fā)光均需較高的鹽度，研究中觀察到，LB01在2216E培養(yǎng)基、發(fā)光培養(yǎng)基上均能正常生長(zhǎng)，發(fā)光情況則是后者優(yōu)于前者，這是由于在培養(yǎng)基中添加了甘油和鈣鹽等有利于發(fā)光反應(yīng)的進(jìn)行的緣故。

明亮發(fā)光桿菌與費(fèi)氏弧菌均為生物發(fā)光傳感器中應(yīng)用的重要菌種[22,24,25]；目前國(guó)內(nèi)應(yīng)用的主要是國(guó)外分離株[4-7]。本研究自東海海域網(wǎng)箱養(yǎng)殖黑鯛腸道內(nèi)分離到一株鰒發(fā)光桿菌，其發(fā)光條件和發(fā)光特性與明亮發(fā)光桿菌相近，有可能在生物發(fā)光傳感器中獲得應(yīng)用。

[1] Edward A M. Bacterial bioluminescence： organization, regulation,and application of the lux genes [J]. FASEB J, 1993, 7： 1016-1022.

[2] 杜宗軍, 王祥紅, 李海峰, 等. 發(fā)光細(xì)菌的研究和應(yīng)用 [J]. 高技術(shù)通迅，2003，(12)： 103-106.

[3] 張進(jìn)興, 逢愛(ài)梅, 孫修勤, 等. 海洋發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光及其應(yīng)用[J]. 發(fā)光學(xué)報(bào), 2007, 28(2)： 167-172.

[4] 朱文杰, 鄭天凌, 李偉民. 發(fā)光細(xì)菌與環(huán)境毒性檢測(cè) [M]. 北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社, 2009.

[5] 韋東普, 馬義兵, 陳世寶, 等. 發(fā)光細(xì)菌法測(cè)定環(huán)境中金屬毒性的研究進(jìn)展 [J]. 生態(tài)學(xué)雜志, 2008, 27(8)： 1413-1421.

[6] 王亞群, 王靜雪, 林洪, 等. 發(fā)光細(xì)菌法檢測(cè)水產(chǎn)品中氯霉素體系的建立 [J]. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 39(1)： 66-70.

[7] 凌云, 趙渝, 徐亞同, 等. 發(fā)光細(xì)菌法在食品安全性檢測(cè)中的應(yīng)用 [J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2005, 24(6)： 106-110.

[8] 杜宗軍, 王祥紅, 李海峰, 等. 一株海洋發(fā)光細(xì)菌的分離鑒定及其發(fā)光條件的初步研究 [J]. 海洋湖沼通報(bào), 2003, (2)： 58-63.

[9] Holt J G, Krieg N R, Sneath P H A, et a1. Bergey’S Manual of Determinative Bacteriology 8th ed [M]. Baltimore, USA： Williams& Wilkins, 1994.

[10] 東秀珠, 蔡妙英. 常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè) [M]. 北京：科學(xué)出版社, 2001.

[11] 劉文強(qiáng), 賈玉萍, 趙宏坤. 16S rRNA在細(xì)菌分類鑒定研究中的應(yīng)用 [J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2006, 27(11)： 15-18.

[12] Chiu H H, Chou H H, Jean W D, et al. Isolation and characterization of marine luminous bacteria from shallow coastal waters of Taiwan[J]. J Microbio Immunol Infect, 2007, 40： 14-23.

[13] Ast J C, Dunlap P V. Phylogenetic resolution and habitat specificity of members of the Photobacterium phosphoreum species group [J].Environ Microbiol, 2005,7(10)： 1641-1654.

[14] Ast J C, Cleenwerck I, Engelbeen K, et al. Photobacterium kishitanii sp. nov., a luminous marine bacterium symbiotic with deep-sea fishes [J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2007, 57： 2073-2078.

[15] Ruby E G, Morin J G. Luminous enteric bacteria of marine fishes： a study of their distribution densities and dispersion [J]. Appl Environ Microbiol, 1979, 38(3)： 406-411.

[16] 王定華, 楊頤康. 一株海洋發(fā)光細(xì)菌的鑒定 [J]. 華東師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）, 1985, (2)： 108-112.

[17] 沈建偉, 楊頤康. 黃海發(fā)光細(xì)菌的分離鑒定 [J]. 海洋與湖沼,1987, 18(4)： 333-340.

[18] 沈建偉, 朱文杰, 吳自榮, 等. 南海中國(guó)沿海發(fā)光細(xì)菌的分離鑒定 [J]. 海洋與湖沼, 1988, 19(1)： 76-80.

[19] 許鴻章. 煙臺(tái)海域發(fā)光細(xì)菌的分離鑒定 [J]. 山東師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）, 1989，4(4)： 34-40.

[20] Orndorff S A, Colwell RR. Distribution and identification of luminous bacteria from the Sargasso sea [J]. Appl Environ Microbiol, 1980, 39(5)： 983-987.

[21] O'Kane D J, Karle V A, Lee J. Purification of lumazine proteins from Photobacterium leiognathi and Photobacterium phosphoreum：bioluminescence properties [J]. Biochemistry, 1985, 24(6)：1461-1467.

[22] Hassan S H, Oh S E. Improved detection of toxic chemicals by Photobacterium phosphoreum using modified Boss medium [J]. J Photochem Photobiol B, 2010, 101(1)： 16-21.

[23] 方宏達(dá), 董燕紅, 袁茵, 等. 海洋發(fā)光弧菌生長(zhǎng)和發(fā)光條件的研究 [J]. 海洋通報(bào), 2007, 26(4)： 66-70.

[24] Faria E C, Treves Brown B J, Snook R D. Water toxicity monitoring using Vibrio fischeri： a method free of interferences from colour and turbidity [J]. J Environ Monit, 2004, 6(2)： 97-102.

[25] Parvez S, Venkataraman C, Mukherji S. A review on advantages of implementing luminescence inhibition test (Vibrio fischeri) for acute toxicity prediction of chemicals [J]. Environ Int, 2006, 32(2)：265-268.

Isolation and identification of a luminous bacterium LB01 and primary studies on its luminescent conditions

MAO Zhi-juan, YANG Ji-fang, WANG Jing, HUANG Ju-jue

(Biological and Environmental College, Zhejiang Wanli University, Ningbo 315100, China)

A luminous bacterium, LB01, was isolated from the gut of a net caged black sea bream (Sparus macrocephlus). Based on the morphology profiles, the physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequencing analysis，strain LB01 was identified as Photobacterium leiognathi．And the luminescent conditions were preliminary determined. The strain irradiated fluorescent light at a wavelength of about 470nm. In liquid culture, under the following conditions, pH value of 5.0～6.0, detection temperature at 20℃, with 3 % NaCl in the detection buffer，the luminous bacterium LB01 showed the strongest luminescence.

Photobacterium leiognathi; identification; luminescent conditions

S942.1

A

1001-6932(2011)04-0441-06

2010-8-31；

2011-2-15

海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)基金 ( 200705014)。

毛芝娟（1973－），女，博士，主要從事海洋病原微生物學(xué)研究。電子郵箱：zhijuanmao@tom.com。