沈玉幫，張俊彬，馮冰冰，李家樂

（上海海洋大學 教育部水產動物種質資源的挖掘與利用重點實驗室, 上海 201306）

基于線粒體COI序列分析對紫貽貝群體遺傳多樣性的研究分析

沈玉幫，張俊彬，馮冰冰，李家樂

（上海海洋大學 教育部水產動物種質資源的挖掘與利用重點實驗室, 上海 201306）

本文采用線粒體COI基因序列分析對我國沿海6個紫貽貝群體124個個體的遺傳多樣性和群體結構進行了初步研究。在紫貽貝6個群體中共發(fā)現13個單倍型和33個核苷酸多態(tài)位點。青島群體單倍型數目是最多的，溫州群體、丹東群體和寧德群體次之。6個紫貽貝群體的基因多樣性為0.569～0.821，核苷酸多樣性為0.015 5～0.051 0，表現出較低的遺傳多樣性。紫貽貝不同群體之間的遺傳分化較小，所有群體之間沒有發(fā)生顯著的遺傳分化。分子方差分析表明，紫貽貝的變異主要存在于群體內。該研究為紫貽貝的可持續(xù)開發(fā)和資源保護提供了一定的理論依據。

紫貽貝；線粒體COI基因；遺傳多樣性

群體異質性是生物持續(xù)存在的內在因素[1]。研究群體遺傳結構是某一群體長期的可持續(xù)保護和管理的重要組成部分，另外，由于在生物進化研究中的作用，群體遺傳結構已經引起了很多科研工作者的興趣[2]。當群體遺傳結構被確定后，將為我們及時地恢復資源提供必要的信息，還可以在養(yǎng)殖管理過程中對群體進行監(jiān)控，特別是那些已經被開發(fā)的海洋生物。

紫貽貝（Mytilus galloprovincialis）屬于貽貝屬，在世界上分布范圍非常廣，原分布于英國和愛爾蘭的南部沿海到法國、伊比利亞島、地中海和黑海。除了這些地方之外，在加利福尼亞、澳大利亞、新西蘭、塔斯馬尼亞、日本、中國東部沿海和南非等地也有報道[3]。而在中國，紫貽貝是中國人工養(yǎng)殖的重要的經濟貝類之一。紫貽貝被認為是一個外來種，20世紀50年代的時候僅見過中國北部大連沿海，現在青島、浙江、福建和廣東等地都有分布[4]。據統(tǒng)計，2004年中國貝類產量達到了 71.7萬噸，占世界貝類產量的 38.6%[5]。雖然我們不能把不同物種各自的產量區(qū)分開來，但有專家認為，紫貽貝大約占到總產量的三分之一。紫貽貝苗種一直以來主要靠自然的野生貝苗，隨著紫貽貝養(yǎng)殖產業(yè)的發(fā)展，對野生苗種的需求不斷提高。

在過去的幾十年時間里，紫貽貝的研究主要集中于生物學方面，包括細胞生物學[6]、生理學[7]、蛋白質組學[8]。對于貽貝屬群體遺傳學研究主要是在 20世紀七八十年代，當時電泳技術為遺傳學研究提供了非常好的方法。自從 1976年以后，對于貽貝屬群體遺傳學和分類學研究有了非常大的進展，特別是分布于北美大西洋沿海的貽貝物種。一直以來，中國對于紫貽貝的群體遺傳結構還未見報道。本文采用線粒體COI序列分析對中國沿海紫貽貝的群體結構與遺傳多樣性進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

紫貽貝樣本在 2007年 7－9月期間分別從丹東、大連灣、秦皇島、青島、溫州和寧德沿海的潮間帶收集。這些區(qū)域紫貽貝養(yǎng)殖苗種主要靠收集野生產卵場的幼體?？偣?29個樣本，固定于無水乙醇保存。這些紫貽貝樣本的具體采集時間，數量見表1。

表1 紫貽貝不同群體采樣地點、時間和樣本數Tab. 1 Sampling localities, time and number of individuals sampled in each population

2.2 DNA 抽提與PCR擴增

采用常規(guī)酚-氯仿法從紫貽貝外套膜中提取總DNA，參照沈玉幫等[9]的方法。經 1%瓊脂糖電泳對DNA質量進行評價，DNA的濃度運用分光光度計測量DNA溶液的260 nm的吸收值。

用于擴增COI基因片段的引物序列為，上游引物 LCO7490：5’-GGTCAACAAATCATA - 3 ’；下游引物 HCO2198：5’-TAAACTTCAGGGTGA- 3’[10]。PCR擴增在eppendorf mastercycle 5333型PCR儀上進行。PCR反應體積為50 μL，其中包括模板DNA 100 ng，各種 dNTP 0.2 mmol·L-1,每個引物濃度為0.2 μmol·L-1，Taq 聚合酶 1U（天根公司），10×緩沖液 5 μL，Mg2+2.0 mmol·L-1，加滅菌雙蒸水至 50 μL。每次反應都設不含模板的對照實驗. PCR反應條件為：94℃ 預變性3 min，然后進行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括 94℃ 50 s，48℃ 50 s，72℃1 min，最后72℃延伸10 min。PCR擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離。純化后的PCR產物送往上海生工生物工程有限公司直接進行雙向測序反應。

表2 紫貽貝不同取樣位點線粒體COI基因單倍型頻率Tab. 2 mtDNA haplotypes distribution of M. galloprovincialis populations

2.3 數據分析

將通過雙向測序獲得的序列進行拼接。拼接好后，在GenBank數據庫中進行BLAST同源性搜索，驗證發(fā)現所獲得的序列確實是COI基因，沒有受到其它 DNA的污染。運用 BIOEDIT軟件（Version 7.0.9）[11]將所有的核苷酸序列翻譯成氨基酸，排除由于測序所造成的堿基錯誤，并進行序列比對，然后再翻譯成核苷酸序列用于數據分析，并以Fasta格式保存。DNASP version軟件[12]被用來估計每個群體的單倍型多樣性（h）[13]和核苷酸多樣性（π）[14]。用 ARLEQUIN 軟件[15]計算 Tijma’s D[16]和 Fu’s Fs值[17]，用來對各個群體的生物統(tǒng)計史（demographic history）進行估計。另外，錯配分布檢驗（mismatch distribution tests）被用于糾正由于群體突然擴張而形成的無效模型。不同群體間的FST被確定同時也進行了顯著性檢驗。最后，AMOVA分析對群體分化進行了定量。這個統(tǒng)計分析都是用ARLEQUIN軟件[15]處理。為了保證結果更加可靠，MODELTEST version3.04軟件[18]被用來估計序列，從而選擇適合該序列的最佳核苷酸替代突變模型。以厚殼貽貝（Mytilus coruscus）為外群，使用 MEGA4.0[19]軟件中鄰接法（neighbor-joining method）構建單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)樹中各個支點的支持率采用 bootstrap法，重復 1 000次，Bootstrap值大于70被認為是可靠的節(jié)點。為了進一步了解紫貽貝的系統(tǒng)地理學史，我們使用了TCS version 1.2軟件[20]構建了最短距離網絡圖（minimum spanning network）。

表3 紫貽貝不同群體單倍型數（N），基因多樣性（H），核苷酸多樣性（π）Tab. 3 Number of haplotypes (N), gene diversity (H), nucleotide diversity (π) for each population

表4 紫貽貝不同群體之間遺傳分化系數FST Tab. 4 Pairwise FST between different populations

3 結 果

3.1 不同群體的遺傳多樣性

對中國沿海紫貽貝6個群體124個個體的COI基因進行直接測序，刪除兩端不可靠的序列，選取中間的593 bp進行分析。比對發(fā)現變異位點有33個，其中26個是簡約信息位點。從124個個體中總共發(fā)現了 13個單倍型。堿基組成存在明顯的偏向性，A、T、G、C含量分別為35.6%、27.2%、15.2%、22.1%，A+T含量為62.8%，G+C含量為37.3%, 與其它貝類的COI基因序列結果類似[21,22]。

單倍型hap1、hap4和hap5在每個群體中都有分布，但hap1是最多的，占所有個體的56.4%（表2）。單倍型 hap2除了未在青島群體出現外，其它群體中都有分布。單倍型 hap3除了在大連灣群體中沒有分布外，其它群體中都有分布。61.5%的單倍型僅僅在一個群體中發(fā)現。青島群體的單倍型數目是最多的（8），溫州群體、丹東群體和寧德群體次之（6）。除了秦皇島群體外，其它群體都有自己特有的單倍型，這些特有的單倍型可以用來進行群體鑒定。

每個群體的單倍型數、基因多樣性和核苷酸多樣性見表 3。寧德群體和丹東群體都有較高的單倍型和核苷酸多樣性。不同群體單倍型多樣性的范圍為 0.569～0.821。其中最高的是寧德群體，最低的是秦皇島群體。而不同群體核苷酸多樣性的范圍是0.014 1～0.017 8。最高的是寧德群體，秦皇島群體最低。

表5 紫貽貝線粒體COI序列分子方差分級分析Tab. 5 AMOVA analysis of all sequences of mtDNA COI gene

2種不同的中性檢驗法被用來對紫貽貝不同群體受到選擇作用的影響進行檢測（表3）。Fu’s Fs 檢驗主要用于檢驗群體擴張, 本研究中所有群體的Fu’s Fs 都是正值，而且都是不顯著的，說明在紫貽貝所有群體中，中性進化的無效假設不能被拒絕。Tajima’D檢驗是通過計算分離位點數與核苷酸差異的平均值之間的產值來獲得。從表3可以看出，紫貽貝任一群體的Tajima’D都是正值，而且沒有出現顯著不等于 0，說明可以用中性突變假說來解釋紫貽貝線粒體COI基因的多態(tài)性，與Fu’s Fs 檢驗結果是相同的。錯配分布檢驗發(fā)現，除了青島群體和大連灣群體外，群體的突然擴張沒有出現在其它的4個群體中（P＜0.05）。

3.2 紫貽貝群體遺傳結構

AIC(Akaike information criterion) 分析表明Tamura-Nei是最佳核苷酸替代突變模型。使用MEGA4.0軟件，以厚殼貽貝為外群，對紫貽貝13個單倍型建立了 NJ樹。紫貽貝單倍型被聚成了 4個不同的具有高支持率的分枝,分別是A、B、C、D（圖1）。分枝A節(jié)點的bootstrap值是74%，分枝B的bootstrap值是65%，分枝C的bootstrap值是71%，分枝D的bootstrap值是99%。分枝A、B、C、D分別包括了3，3，3，4個單倍型。分枝A、B、C中的單倍型來自全部的6個群體，分枝D中的單倍型來自于 4個群體（QD、DLW、DD）。對于不同的單倍型也做了網狀分析，但是 13個單倍型沒有顯示清楚的網狀結構。

運用分子方差變異（AMOVA）和固定指數FST對遺傳結構加以驗證。不同群體間FST的結果見表4。所有 6個紫貽貝群體之間都沒有發(fā)生顯著遺傳分化，FST值從0.008 9到0.050 9（P＞0.05），最大的遺傳分化存在于寧德群體與青島群體之間。分子方差變異分析表明：98.91%的變異存在于群體內，而群體間的遺傳變異為1.09%（表5）。

4 討 論

4.1 紫貽貝群體的遺傳多樣性分析

對于群體遺傳學、系統(tǒng)發(fā)育學、分類學、進化遺傳學等遺傳學研究來說，許多生物的遺傳多樣性分析是非常必要的[23]，它是形成生物多樣性的基礎，也是物種進化潛能的保證。本研究主要是對中國沿海6個紫貽貝群體的線粒體COI基因片段序列的多態(tài)性進行分析。所獲得的結果與其它海水貝類同一基因序列的結果[24-26]相比，在單倍型數、基因多樣性和核苷酸多樣性上，具有較低的遺傳多樣性。在伊比利亞半島采用同工酶[27]、線粒體[28]、微衛(wèi)星[30]的方法發(fā)現紫貽貝具有高的遺傳多樣性。而對于中國沿海的紫貽貝遺傳多樣性研究的未見其它報道。從南到北紫貽貝群體的遺傳多樣性不高，所有被研究群體間共有單倍型較多（表2），進而說明了紫貽貝引進到中國的時間不長，關于紫貽貝類似的情況在南非也被發(fā)現[31]。同時，我們所選擇采樣區(qū)都具有非常大的紫貽貝群體，因為這些區(qū)域都是我國主要的紫貽貝養(yǎng)殖區(qū)域，結果表明大的群體并不代表較高的遺傳多樣性，可能是由于貝類具有高繁殖力和較強的抗逆性，即使在海洋環(huán)境條件很惡劣的條件下，還可以繼續(xù)存活。

圖1 紫貽貝線粒體COI基因不同單倍型鄰接樹Fig. 1 Neighbor-joining tree based on mtDNA COI sequences

據記載，紫貽貝在中國沿海最先被發(fā)現于北方大連沿海[4]。紫貽貝群體并沒有出現從北方到南方逐步降低的情形，而是寧德和丹東群體具有略高的遺傳多樣性，其他4個群體的遺傳多樣性相對較低，可能是由以下3個因素中的一個或者是多個因素影響的。像大連灣群體，遺傳多樣性低可能是由奠基效應引起的。青島群體可能只是人為或者是無意識地如運輸船等從其它地方帶來的少量個體后形成的。另一個原因可能是過度采捕導致的。遼寧每年紫貽貝產量非常大。除了鮮活食用外，還制成罐頭、貽貝油和干制品淡菜等美味食品。大連灣群體也有可能是由此原因引起的。第三個原因可能是采集樣本量少。Diz和Presa運用微衛(wèi)星標記研究西班牙紫貽貝遺傳多樣性時就發(fā)現大樣本與等位基因多樣性是有關系的[32]。

4.2 紫貽貝群體遺傳結構

紫貽貝是一種適應性非常強的物種，很容易適應各種各樣的環(huán)境因素，包括溫度[33]，因此在世界上好多地方被無意地引入，并且形成了種群，包括日本、南非、加利福尼亞和智利[34]。 在中國，據王禎瑞記載，紫貽貝是一種外來種。中國紫貽貝來自于哪里，到現在還未有記載。

FST常用來表示2個群體之間的分化程度，在0～1的范圍內，FST值越大表示兩個群體的分化程度越高。本研究中，不同群體之間FST的范圍為0.008 9～0.050 9（表4），說明紫貽貝群體之間的遺傳差異非常小。所有群體之間的種群分化都很小，并且不顯著。這可能是由于各群體還沒有經過足夠長的時間和完全的地理隔離來累積足夠多的特有的突變[35]，例如各群體之間頻繁的基因流。從 NJ法建立的系統(tǒng)樹來看這 6個紫貽貝群體也沒有完全分開,而是不同群體的單倍型錯亂交織在一起。從分子方差分析（AMOVA）來看，基本上全部的變異都是存在群體內（表5），與FST的結果是一致的。

在中國紫貽貝的遺傳結構非常小，在沿海發(fā)現也只是在 20世紀四五十年代，可能是由于時間短的緣故，還未形成明顯的群體遺傳分化[36]。但是紫貽貝在世界各海域被認為是一種適應性很強的貝類，從中國的情況也進一步可以說明。從丹東到寧德二千多公里的范圍，都有紫貽貝的存在，可能是由于紫貽貝幼體在早期發(fā)育階段處于浮游狀態(tài)的緣故[37]，因為這段時期是紫貽貝群體棲息地向周圍延伸的主要時期。另外也有可能是人為的有意引入，像寧德地區(qū),經常從大連采購苗種到當地進行養(yǎng)殖，或者是無意識的帶入如船。

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Genetic diversity of blue mussel Mytilus galloprovincialis in China based on sequence analyses of mitochondrial COI gene

SHEN Yu-bang, ZHANG Jun-bin, FENG Bing-bing, LI Jia-le

（Key laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Ministry of Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China）

Genetic biodiversity of Mytilus galloprovincialis was estimated, based on sequence analyses of the mitochondrial cytochrome oxidase Ⅰ(mtDNA COI) gene, employing 124 individuals of 6 groups along the coast of eastern and southern china. 13 haplotypes and 33 variation sites were observed in the sequences of the 124 individuals.QD population had the greatest number of haplotypes, while secondary for WZ population, DD population and ND population. Among all six populations, gene diversities ranged from 0.569 to 0.821, and the nucleotide diversities from 0.0155 to 0.0510, suggesting that M. galloprovincialis has low genetic diversity. The pairwise estimates of FSTbetween M. galloprovincialis populations were small, and no significant genetic differentiation was observed between populations. AMOVA analysis showed that a large proportion of variation was attributed within population of M.galloprovincialis. This study provides objective data for the sustainable exploitation and fishery management of M.galloprovincialis.

Mytilus galloprovincialis; mtDNA COI; genetic diversity

A

1001-6932(2011)04-0435-06

2010-04-03；

2011-04-02

上海市重點學科建設項目（Y1101）；上海市優(yōu)青項目（B81010615）。

沈玉幫（1981－），男，江蘇鹽城人，博士研究生，專業(yè)方向為水產動物種質資源與種苗工程。E-mail：ybshen1981@126.com。

李家樂，教授，主要從事水產動物種質資源與遺傳育種研究。E-mail：jlli2009@126.com。