張曉君，閻斌倫，梁利國，秦國民，畢可然

（淮海工學院 海洋學院 江蘇省海洋生物技術(shù)重點建設(shè)實驗室，江蘇 連云港 222005）

半滑舌鰨病原鰻利斯頓氏菌雙重PCR檢測方法的研究

張曉君，閻斌倫，梁利國，秦國民，畢可然

（淮海工學院 海洋學院 江蘇省海洋生物技術(shù)重點建設(shè)實驗室，江蘇 連云港 222005）

對引起江蘇連云港工廠化養(yǎng)殖半滑舌鰨大量死亡的病原鰻利斯頓氏菌，進行了基于溶血素和金屬蛋白酶兩種基因的雙重PCR檢測。根據(jù)鰻利斯頓氏菌溶血素基因和金屬蛋白酶基因序列設(shè)計2對特異性引物，在同一PCR反應(yīng)體系中，鰻利斯頓氏菌可同時擴增出上述2種基因片段，擴增片段大小分別為493 bp和248 bp，兩對引物對5種其他水產(chǎn)動物病原菌無交叉反應(yīng)，敏感性檢測結(jié)果為該雙重PCR最低能檢測8×102CFU/mL的鰻利斯頓氏菌，最低能檢測0.171 875 ng/μL的鰻利斯頓氏菌基因組DNA。對發(fā)病半滑舌鰨潰瘍組織、肝臟及養(yǎng)殖用水進行雙重PCR檢測，呈陽性反應(yīng)的樣品可分離出優(yōu)勢生長的鰻利斯頓氏菌。該實驗表明兩種不同基因綜合檢測病原鰻利斯頓氏菌，進一步提高了其PCR檢測的準確性和特異性，建立了一種病原鰻利斯頓氏菌快速、準確的雙重PCR檢測方法。

半滑舌鰨；鰻利斯頓氏菌；溶血素基因；金屬蛋白酶基因；雙重PCR

隨著半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，病害問題日趨嚴重，尤其是由鰻利斯頓氏菌（Listonella anguillarum）引起的大量死亡在多家養(yǎng)殖場頻繁發(fā)生，已構(gòu)成制約其養(yǎng)殖發(fā)展的重大障礙，給養(yǎng)殖生產(chǎn)造成了很大的經(jīng)濟損失[1,2]。鰻利斯頓氏菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖動物中常見且重要的病原菌，該菌于1985年由MacDonell和Colwell等提議由弧菌屬（Vibrio Pacini 1954）轉(zhuǎn)入利斯頓氏菌屬（Listonella MacDonell and Colwell 1986），該菌傳統(tǒng)的檢驗方法包括形態(tài)學檢測、生理生化特征檢測等，這些檢測手段不僅工作量大，而且耗時長, 已遠遠不能滿足水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)上的診斷要求。因此選擇合適的分子靶標，研究開發(fā)靈敏度高、特異性強的病原鰻利斯頓氏菌簡便、快速檢測方法已十分重要，在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物處于帶菌狀態(tài)或大規(guī)模爆發(fā)細菌性疾病之前能進行準確的檢測，這是傳統(tǒng)方法無法比擬的。尤其是多種不同基因綜合檢測以進一步提高其準確性和特異性，將為鰻利斯頓氏菌引起的水產(chǎn)病害的監(jiān)測及控制奠定良好的基礎(chǔ)。

水產(chǎn)動物病原菌在生長和繁殖過程中，細胞不斷向環(huán)境中釋放出代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物對于細胞吸收營養(yǎng)物質(zhì)、吸附和入侵宿主機體、在宿主體內(nèi)擴散、繁殖以及抵抗宿主免疫因子的免疫作用等具有極為重要的作用。如胞外蛋白酶、溶血素、細胞毒素等胞外產(chǎn)物是對宿主產(chǎn)生毒性的主要物質(zhì)，可以直接破壞宿主機體的體質(zhì)，引起宿主的發(fā)病甚至死亡。目前溶血素及胞外蛋白酶被認為是鰻利斯頓氏菌重要的毒力因子[3-6]，本文以編碼溶血素和金屬蛋白酶的兩種基因為靶基因建立了快速檢測病原鰻利斯頓氏菌的雙重PCR方法，病原鰻利斯頓氏菌可擴增出大小約 493 bp的溶血素基因和大小約248 bp的金屬蛋白酶基因，水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中常見的病原哈氏弧菌、愛德華氏菌、美人魚弧菌、魚腸道弧菌及副溶血弧菌等均未擴增出特異性條帶，表明該雙重PCR可用于鰻利斯頓氏菌的快速檢測，并具有較高的準確性和特異性。

1 材料與方法

1.1 菌株

供試鰻利斯頓氏菌分離自江蘇連云港贛榆縣工廠化養(yǎng)殖半滑舌鰨發(fā)病幼魚，供試對照副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、哈氏弧菌（Vibrio harveyi）、美人魚弧菌（Vibrio damsela）、魚腸道弧菌（Vibrio ichthyoenteri）及愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）均分離自發(fā)病水產(chǎn)養(yǎng)殖動物，已通過表型及分子鑒定[7-11]，本實驗室保存供用，菌株編號及在GenBank 登錄號見表1。

表1 供試菌株及其來源Tab. 1 Origin and species of tested bacteria

1.2 細菌模板DNA的制備

試驗所需細菌模板DNA按細菌基因組DNA抽提試劑盒及煮沸兩種方法提取。

細菌基因組DNA抽提試劑盒法：取純培養(yǎng)菌分別接種于含鹽1 %的LB肉湯中28℃培養(yǎng)16 h，按上海賽百盛基因技術(shù)有限公司生產(chǎn)的小量細菌基因組DNA抽提試劑盒所述方法提取DNA，作為PCR模板。

煮沸法：取1 mL菌液離心1 min（12 000 r/min），棄上清，將菌體懸浮于 100 μL的滅菌蒸餾水中，100℃煮沸10 min，冰浴中冷卻后離心10 min（12 000 r/min）, 取上清作為PCR模板。

1.3 引物設(shè)計與合成

以溶血素基因為靶基因設(shè)計鰻利斯頓氏菌的特異性檢測引物：正向引物序列為 5'-TGC GCT ATA TTG TCG ATT TCA GTT-3'，反向引物序列為5'-GCA CCC GTT GTA TCA TCA TCT AAG-3'，目的片段大小約為493 bp；以金屬蛋白酶基因為靶基因設(shè)計鰻利斯頓氏菌的特異性檢測引物：正向引物序列為 5'-CCT TTA ACC AAG TGG GCG TA-3'，反向引物序列為5'-CGA TTT GTT GTA AGG GCG ACA AT-3'，目的片段大小約為248 bp[12]。2對引物均由上海生物工程技術(shù)公司合成。

1.4 PCR各反應(yīng)條件的優(yōu)化及電泳分析

以溶血素和金屬蛋白酶2種基因設(shè)計的引物分別對模板進行單一擴增；在同一次PCR反應(yīng)中, 應(yīng)用同一個PCR反應(yīng)程序, 用上述2種引物同步對模板進行擴增。對PCR各循環(huán)參數(shù)和各引物濃度等進行優(yōu)化，篩選出單一PCR及雙重PCR反應(yīng)中最佳反應(yīng)模式。

PCR擴增后的產(chǎn)物，用1.2%瓊脂糖凝膠在80 V下電泳45 min，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄。

1.5 雙重PCR反應(yīng)的特異性檢測

以副溶血弧菌、哈氏弧菌、美人魚弧菌、魚腸道弧菌及愛德華氏菌為對照菌株，按上述優(yōu)化的反應(yīng)條件進行PCR擴增，分別進行上述2對引物雙重PCR的特異性檢驗。

1.6 PCR反應(yīng)的靈敏性檢測

分別從菌液稀釋以及模板DNA稀釋2方面來檢測方法的靈敏性。

菌液稀釋：濃度為8×108CFU/mL的鰻利斯頓氏菌培養(yǎng)物分別用滅菌雙蒸水進行 10倍系列稀釋為：8×108CFU/mL、8×107CFU/mL、8×106CFU/mL、8×105CFU/mL、8×104CFU/mL、8×103CFU/mL、8×102CFU/mL、8×10 CFU/mL、8 CFU/mL、8×10-1CFU/mL，共10個稀釋倍數(shù)，按1.2所述煮沸法，取1 mL菌液提取DNA作為PCR模板進行檢測。

模板DNA稀釋：小量細菌基因組DNA抽提試劑盒提取的鰻利斯頓氏菌基因組DNA，從88ng/μL起 2 倍連續(xù)稀釋為：88 ng/μL、44 ng/μL、22 ng/μL、11 ng/μL、5.5 ng/μL、2.75 ng/μL、1.375 ng/μL、0.687 5 ng/μL、0.343 75 ng/μL、0.171 875 ng/μL、0.085 937 5 ng/μL，共11個稀釋倍數(shù)，按上述方法進行PCR檢測。

1.7 發(fā)病半滑舌鰨及養(yǎng)殖用水雙重PCR檢測

取連云港贛榆工廠化養(yǎng)殖出現(xiàn)腹水及潰瘍的發(fā)病半滑舌鰨，無菌操作取潰瘍病變組織及肝臟勻漿后用營養(yǎng)肉湯增菌培養(yǎng) 6 h, 池塘養(yǎng)殖用水同樣用營養(yǎng)肉湯增菌培養(yǎng)6 h，增菌液提取DNA并進行PCR擴增。同時發(fā)病半滑舌鰨按常規(guī)方法進行細菌分離及檢測。

2 結(jié) 果

2.1 雙重PCR檢測方法的確定

通過對不同反應(yīng)條件下DNA擴增結(jié)果的比較，確定了鰻利斯頓氏菌的最佳雙重PCR模式。以溶血素和金屬蛋白酶基因為靶基因同步檢測的 PCR反應(yīng)條件為：95℃預變性3 min，接94℃變性1 min、55℃復性1 min、72℃延伸2 min、30個循環(huán)，然后72℃溫育 6 min。在 40 μL反應(yīng)體系中含有：水28.8 μL，10×PCR 緩沖液 4 μL，MgCl2（25 mM）3.2 μL，4×dNTP 混合物 0.8 μL，引物各 0.4 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.4 μL，模板 DNA 2 μL。

2.2 單一及雙重PCR特異性擴增結(jié)果

應(yīng)用上述 PCR檢測方法對鰻利斯頓氏菌和其它水產(chǎn)動物病原菌基因組DNA分別進行單一及雙重 PCR 擴增，結(jié)果以溶血素基因為靶基因單一擴增，鰻利斯頓氏菌株只擴增出約493 bp一條帶；以金屬蛋白酶基因為靶基因單一擴增，鰻利斯頓氏菌株只擴增出248 bp一條帶；以溶血素和金屬蛋白酶2種基因為靶基因同步擴增，鰻利斯頓氏菌株可擴增出493 bp和248 bp 2條帶，而其它5種水產(chǎn)動物病原菌（副溶血弧菌、哈氏弧菌、美人魚弧菌、魚腸道弧菌及愛德華氏菌）均未出現(xiàn)目的擴增條帶（圖1）。表明本實驗建立的鰻利斯頓氏菌雙重PCR檢測方法具有較強的特異性。

圖1 鰻利斯頓氏菌單一及雙重PCR特異性檢測結(jié)果M, DL2000; 1, 金屬蛋白酶基因擴增片段; 2, 溶血素基因擴增片段; 3,溶血素和金屬蛋白酶基因同步擴增片段;4-8, 5種病原菌對照Fig. 1 Specificity of single-duplex PCR for detection of L. anguillarum M, DL2000; 1, amplified fragment of metalloprotease; 2, amplified fragment of hemolysin; 3, simultaneous amplified fragments of hemolysin and metalloprotease; 4-7, control of five pathogenic bacteria

2.3 菌液稀釋雙重PCR檢測的靈敏度

菌液系列稀釋后按 1.2所述煮沸方法提取DNA，按2.1優(yōu)化出的雙重PCR反應(yīng)條件進行檢測，結(jié)果在40 μL反應(yīng)體系中，模板DNA加入2 μL，菌體濃度自 8×106～8×108CFU/mL均可擴增出清晰條帶，菌體濃度為8×102～80×105CFU/mL擴增條帶暗淡，菌體濃度在 8×10-1CFU/mL至80CFU/mL均未擴增出條帶（圖 2），表明本實驗建立的雙重PCR方法檢測鰻利斯頓氏菌菌體靈敏為8×102CFU/mL。

圖2 鰻利斯頓氏菌菌液稀釋法雙重PCR檢測結(jié)果M,DL2000; 1-10,雙重PCR擴增片段（菌液系列稀釋：依次為8×108CFU/mL～8×10-1CFU/mL）Fig. 2 Sensitivity of duplex PCR for detection of L. anguillarum dilution M, DL2000; 1-10, amplified fragments of duplex PCR (L. anguillarum serially diluted from 8×108CFU/mL-8×10-1CFU/mL)

2.4 模板DNA稀釋雙重PCR檢測的靈敏度

細菌基因組DNA抽提試劑盒提取的DNA 2倍系列稀釋后作模板，按2.1優(yōu)化出的雙重PCR反應(yīng)條件進行檢測，結(jié)果表明在40 μL反應(yīng)體系中，模板 DNA 加入 2 μL（濃度 88～0.085 937 5 ng/μL），鰻利斯頓氏菌基因組DNA濃度在88 ng/μL至0.343 75 ng/μL的范圍均可擴增出明亮條帶，基因組DNA濃度在0.171 875 ng/μL條帶較暗淡，基因組DNA濃度小于0.085 9375 ng/μL無擴增條帶（圖3）, 表明本實驗建立的雙重 PCR方法對鰻利斯頓氏菌模板DNA濃度的檢出靈敏度為0.171 875 ng/μL。

圖3 鰻利斯頓氏菌模板DNA稀釋法雙重PCR檢測結(jié)果M, DL2000; 1-11, 雙重PCR擴增片段（模板DNA 2倍系列稀釋：依次為88ng-0.0859375 ng）Fig. 3 Sensitivity of dulplex PCR for detection of purified chromosomal DNA dilution M, DL2000; 1-11, amplified fragments of duplex PCR (purified chromosomal DNA of L. anguillarum serially diluted 2-fold from 88 ng/μL-0.0859375 ng/μL)

2.5 發(fā)病半滑舌鰨及養(yǎng)殖用水的雙重PCR檢測結(jié)果

對發(fā)病半滑舌鰨及養(yǎng)殖用水進行雙重 PCR檢測，結(jié)果半滑舌鰨潰瘍組織及肝臟均擴增出溶血素和金屬蛋白酶2種基因片段，養(yǎng)殖用水檢測結(jié)果為陰性（圖 4）。發(fā)病半滑舌鰨潰瘍組織及肝臟經(jīng)細菌分離、形態(tài)及理化特性等表型生物學特性、16 S rRNA與gyrB基因的分子檢測，表明分離自發(fā)病半滑舌鰨的優(yōu)勢生長菌為利斯頓氏菌屬的鰻利斯頓氏菌。

圖4 發(fā)病半滑舌鰨及養(yǎng)殖用水的雙重PCR檢測結(jié)果M, DL2000; 1, 潰瘍組織; 2, 肝臟; 3, 養(yǎng)殖用水; 4, 陰性對照Fig. 4 Results of duplex PCR for detection of L. anguillarum from diseased Cynoglossus semilaevis and tank water M, DL2000; 1, ulcer tissue; 2, liver; 3, tank water; 4, control

3 討 論

鰻利斯頓氏菌是可引起多種海水魚類發(fā)生出血性敗血癥的病原菌。2008－2009年間，江蘇連云港市贛榆縣工廠化養(yǎng)殖半滑舌鰨發(fā)生嚴重疾病，死亡率達到80%。病魚主要癥狀為胃腸道出血，頭部、鰓蓋及鰭基出血，腹腔積有大量腹水，尾鰭腐爛，個別病魚腸道有白濁物等，經(jīng)細菌學及致病性檢驗表明病原為鰻利斯頓氏菌，且對半滑舌鰨具有強致病性。因此，建立該病原菌快速、簡便、準確的檢測方法以便對其引起的疾病進行有效的防治是十分必要的。

目前，應(yīng)用于鰻利斯頓氏菌檢測的技術(shù)主要有：熒光抗體技術(shù)（fluorescent antibody technique，F(xiàn)AT）、酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA 法）、核酸雜交技術(shù)（Nucleic acid hybridization）、PCR 技術(shù)（Polymerase Chain Reaction，PCR）等，這些生物學技術(shù)已在鰻利斯頓氏菌檢測方面多有應(yīng)用[13-17]。本文建立的鰻利斯頓氏菌的雙重PCR的特異性試驗結(jié)果表明，基于溶血素和金屬蛋白酶基因序列設(shè)計的2對特異性引物僅對所研究的鰻利斯頓氏菌可擴增出大小分別為493 bp和248 bp的2個基因片斷，對供試的5種水產(chǎn)動物其他病原細菌（副溶血弧菌、哈氏弧菌、美人魚弧菌、魚腸道弧菌及愛德華氏菌）均無交叉反應(yīng)，說明設(shè)計的引物對病原鰻利斯頓氏菌具有良好的特異性；雙重PCR檢測靈敏度結(jié)果顯示，該雙重 PCR對病原鰻利斯頓氏菌的菌體濃度檢出靈敏度為 8×102CFU/mL，對鰻利斯頓氏菌模板 DNA濃度的檢出靈敏度為0.171 875 ng/μL，其靈敏度能滿足臨床病原鰻利斯頓氏菌株檢測的需要。該方法可用于在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物處于帶菌狀態(tài)或大規(guī)模暴發(fā)鰻利斯頓氏菌病之前進行準確的檢測。

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Detection of pathogenic Listonella anguillarum isolated from Cynoglossus semilaevis by duplex PCR

ZHANG Xiao-jun, YAN Bin-lun, LIANG Li-guo, QIN Guo-min, BI Ke-ran

(Key Laboratory of Oceanic Biotechnology of Jiangsu, College of Ocean, Huaihai Institute of Technology, Lian Yungang 222005, China)

L. anguillarum is the cause of the high mortalities of cultured half-smooth tongue sole (Cynoglossus semilaevis) during cultivation in Lian Yungang, Jiangsu province. In this study, the detection of the pathogenic L.anguillarum by duplex PCR based on hemolysin and metalloprotease genes were conducted. Two pairs of specific primers were designed based on hemolysin and metalloprotease gene sequence, and these two primers could simultaneously amplify 493 bp and 248 bp gene fragments from chromosomal DNA of L. anguillarum in one PCR reaction, and no cross reaction was detected in 5 other pathogenic bacteria tested. The results of sensitivity of dulplex PCR showed that the two primers could detect L. anguillarum as low as 8×102CFU/mL, and detect purified chromosomal DNA as low as 0.171 875 ng/μL. Dominant L. anguillarum could be isolated from the positive sample of duplex PCR through detecting ulcer tissues and liver of diseased Cynoglossus semilaevis. The specific PCR method for detection of L. anguillarum was established, and the PCR protocol simultaneously amplifying different gene fragments of the L. anguillarum could be useful in the specific, accurate and rapid detection of pathogenic L. anguillarum.

Cynoglossus semilaevis; Listonella anguillarum; hemolysin gene; metalloprotease gene; duplex PCR

S917.1

A

1001-6932(2011)04-0430-05

2010-04-12；

2010-10-28

江蘇省水產(chǎn)三項工程項目（PJ2010-58）；江蘇省自然科學基金項目（BK2009163）。

張曉君（1969－），河北秦皇島市人，教授，博士，主要從事水產(chǎn)動物病害及病原微生物學研究。電子郵箱：zxj9307@163.com。