武祥偉，劉賢德，王志勇

（集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361021）

fSSR分析技術(shù)的建立及在大黃魚（Larimichthys crocea）親子鑒定中的應(yīng)用

武祥偉，劉賢德，王志勇

（集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361021）

以大黃魚（Larimichthys crocea）為材料，對熒光標(biāo)記微衛(wèi)星（fSSR）分析體系進(jìn)行了優(yōu)化，建立了適合大黃魚fSSR分析的最佳條件。與常規(guī)的銀染法相比，該方法成本略高，但其分辨率高，可重復(fù)性強(qiáng)，檢測效率為銀染法的6～10倍。利用優(yōu)化的fSSR技術(shù)進(jìn)行了大黃魚親子鑒定的研究，結(jié)果顯示在使用6對引物的情況下，大黃魚兩個群的親子鑒定率超過99%。

fSSR；大黃魚；親子鑒定；Gel-Scan 3000

微衛(wèi)星（microsatellite），又稱簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR），是當(dāng)前應(yīng)用較為廣泛的 DNA分子標(biāo)記之一[1]。微衛(wèi)星檢測的方法有多種，如同位素法[2]、銀染法[3]、測序法[4]、熒光標(biāo)記法[5]。目前大部分實(shí)驗(yàn)室都采用銀染法，此方法具有操作簡便、無同位素污染等優(yōu)點(diǎn)，但需時較長，慢速銀染法需要2～3 h，快速銀染法也在半小時以上。熒光標(biāo)記微衛(wèi)星（fSSR）檢測技術(shù)是近年來發(fā)展的一項新技術(shù)，其基本原理是在一條或兩條引物的5’端標(biāo)記一種熒光素，如HEX，F(xiàn)AM等，用此種引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠上分離，在電泳過程中熒光素經(jīng)激光照射激發(fā)出熒光被捕捉到而成像。此種方法無需銀染顯色，分析效率較高。但目前尚未見使用 fSSR方法對大黃魚進(jìn)行分析的報道。

本研究使用Gel-Scan 3000激光掃描電泳系統(tǒng)，對 SSR反應(yīng)中多個因子進(jìn)行優(yōu)化，建立了大黃魚fSSR分析體系，并使用優(yōu)化的fSSR技術(shù)對2個群的大黃魚進(jìn)行了親子鑒定，以驗(yàn)證該體系的有效性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 fSSR體系建立材料 2009年采自福建省寧德市官井洋海區(qū)的養(yǎng)殖大黃魚，剪取部分鰭條，保存于75 %乙醇，用于DNA抽提。大黃魚SSR引物[6,7]，由上海英駿生物工程公司合成，上游引物5’端標(biāo)記熒光素HEX（表1）。

1.1.2 親子鑒定材料 所用材料取自福建省寧德市大黃魚養(yǎng)殖基地，由集美大學(xué)大黃魚品種選育課題組提供。2007年3月，從經(jīng)過室內(nèi)升溫強(qiáng)化培育的候選親本群體中挑選7雌8雄共15尾性狀優(yōu)良、體質(zhì)健壯、成熟度較好的個體，采用大黃魚常規(guī)育苗生產(chǎn)中所用的“人工催產(chǎn)、隨機(jī)交配”繁育措施建立了2個窩選群體，分別包含4♀×4♂（1#群），3♀×4♂（3#群）。親魚產(chǎn)卵結(jié)束后收集受精卵，室內(nèi)孵化并于1個月后轉(zhuǎn)移至海區(qū)網(wǎng)箱養(yǎng)殖。親本剪取部分背鰭保存，備用。2008年10月分別從2群子代（20月齡）中分別隨機(jī)選取279尾和315尾，剪取部分背鰭。以上樣本固定于75%的酒精中，用于下一步的DNA提取和親子鑒定分析。

表1 大黃魚SSR引物信息Tab. 1 SSR primers information of larger yellow croaker

1.2 方法

1.2.1 DNA抽提 采用傳統(tǒng)酚-氯仿法提取基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，并將濃度調(diào)整至30 μg/mL，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SSR分析 對影響 PCR反應(yīng)的主要因子設(shè)置梯度進(jìn)行單因素優(yōu)化分析，優(yōu)化時每梯度使用2尾大黃魚樣品。PCR在ABI thermal cycler（美國ABI公司）上進(jìn)行，初始反應(yīng)體系參考任鵬等[7]的報道。

1.2.3 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 Gelscan 3000電泳程序：PCR產(chǎn)物中加入1/6體積的6×Loading Buffer（98%去離子甲酰胺，1.75% 10 mmol/L EDTA，0.25%溴酚藍(lán)），95℃變性5 min后迅速置于冰上，取1 μL于5%變性聚丙烯酰胺凝膠（19：1）上電泳。以 GenScanTM-500 TAMRATM Size Standard作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，電泳完畢后保存掃描圖像，并使用ONE DScan software分析統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

Bio-Rad電泳程序：聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染程序參照王志勇等使用的方法[8]進(jìn)行。

1.2.4 親子鑒定分析 使用Cervus 3.0軟件中鑒定效率最高的NE-PP模型作為分析模式[9,10]，首先根據(jù)親本基因頻率進(jìn)行模擬分析，之后依據(jù)子代基因型進(jìn)行親子鑒定分析。

2 結(jié) 果

2.1 影響大黃魚fSSR體系的因素

2.1.1 模板濃度 7個DNA濃度：5 ng、10 ng、15 ng、20 ng、30 ng、50 ng、60 ng，電泳結(jié)果（圖1）顯示各濃度均能擴(kuò)增出清晰目的帶，從體系穩(wěn)定性與經(jīng)濟(jì)角度考慮，本文選擇10 ng的DNA濃度。

2.1.2 引物濃度 6個引物濃度梯度：0.08 μmol/L、0.1 μmol/L、0.15 μmol/L、0.2 μmol/L、0.3 μmol/L、0.35 μmol/L的電泳圖譜（圖2）顯示后2個濃度擴(kuò)增較好?；诮档统杀究紤]，引物濃度為0.3 μmol/L較合適。

圖1 DNA濃度對fSSR擴(kuò)增的影響Fig.1 Effect of template concentration on fSSR reaction

圖2 引物濃度對fSSR擴(kuò)增的影響Fig. 2 Effect of primer concentration on fSSR reaction

2.1.3 Mg2+濃度 7個 Mg2+濃度 1 mmol/L、1.2 mmol/L、1.5 mmol/L、1.8 mmol/L、2.0 mmol/L、2.3 mmol/L、2.5 mmol/L電泳圖譜（圖3）顯示濃度過高出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，Mg2+為1.2 mmol/L目的帶亮度合適。

圖3 Mg2+濃度對fSSR擴(kuò)增的影響Fig. 3 Effect of Mg2+ concentration on fSSR reaction

2.1.4 Taq DNA聚合酶濃度 7個Taq DNA聚合酶濃度 0.2 U、0.5 U、0.7 U、1 U、1.2 U、1.5 U、2 U電泳圖譜（圖4）表明 Taq DNA聚合酶量過高易引起非特異性擴(kuò)增，0.2 U的Taq DNA聚合酶量是經(jīng)濟(jì)的選擇。

圖4 Taq DNA聚合酶濃度對fSSR擴(kuò)增的影響Fig. 4 Effect of Taq DNA polymerase concentration on fSSR reaction

2.1.5 PCR循環(huán)次數(shù) 本文設(shè)置20循環(huán)、25循環(huán)、30循環(huán)、35循環(huán)、40循環(huán)5個循環(huán)次數(shù)梯度。電泳顯示，循環(huán)數(shù)少，檢測不到目的帶，從擴(kuò)增條帶的清晰度、特異性方面考慮，適合的循環(huán)擴(kuò)增次數(shù)應(yīng)不少于30循環(huán)（圖5）。

2.1.6 PCR體系體積 本文設(shè)置3個反應(yīng)體系體積：5 μL、10 μL、15 μL。電泳圖譜（圖 6）顯示 3組間無明顯差異，均能擴(kuò)增出穩(wěn)定清晰的電泳條帶，基于穩(wěn)定性和成本考慮，本研究選擇10 μl體系。?

圖5 PCR循環(huán)次數(shù)對fSSR擴(kuò)增的影響Fig. 5 Effect of the number of PCR cyclers on fSSR reaction

圖6 PCR體系體積對fSRR擴(kuò)增的影響Fig. 6 Effect of PCR total volume on fSSR reaction

2.1.7 fSRR體系的建立 依據(jù)上述確立的條件，本文建立了一套基于Gel-Scan 3000實(shí)時激光掃描電泳系統(tǒng)的大黃魚fSSR分析體系（表2），并結(jié)合實(shí)際應(yīng)用進(jìn)行了微調(diào)。

PCR程序：95 ℃ 5 min；33個循環(huán)包括94 ℃30 s，退火溫度 30 s，72 ℃ 50 s；保溫 72 ℃ 15 min。

表2 大黃魚fSSR反應(yīng)體系Tab. 2 fSSR reaction system for large yellow croaker

2.1.8 fSSR體系穩(wěn)定性檢測 使用12尾養(yǎng)殖大黃魚樣品與3個大黃魚SSR位點(diǎn)（表1）檢測fSSR體系的穩(wěn)定性。電泳圖譜顯示目的條帶清晰整齊，重復(fù)性強(qiáng)（圖7），3個位點(diǎn)分別檢測到24、23、22個目的條帶。

圖7 基于Gel-Scan 3000的3個SSR位點(diǎn)電泳圖譜Fig. 7 Electrophoresis pattern of three microsatellite markers based on Gel-Scan 3000（A： LYC0002, B： LYC0004, C： LYC0066）

2.2 普通聚丙烯酰胺凝膠電泳

使用普通PCR擴(kuò)增體系[7]與銀染方法，對上述樣品與微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，3個SSR位點(diǎn)（未標(biāo)記HEX）在12尾大黃魚中分別檢測到23、21、20個目的條帶（圖8）。

圖8 3個SSR位點(diǎn)的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜Fig. 8 Polyacylamide gel electrophoresis profile of three microsatellite loci（A： LYC0002, B： LYC0004, C： LYC0066）

2.3 fSSR在大黃魚親子鑒定中的應(yīng)用

本文6對SSR引物（表1），使用本文所建立的方法，對 1#和 3#大黃魚群體進(jìn)行了親子鑒定研究，結(jié)果在95%置信度下，1#和3#群的鑒定率均在99%（表 3）以上，顯示該方法具有較好的鑒定效果。

表3 2個群的大黃魚鑒定結(jié)果Tab. 3 Parentage results for two batches of large yellow croaker

3 討 論

3.1 fSSR體系的建立

fSSR體系中，模板的用量是首要影響因素，其用量的多少直接影響到 PCR擴(kuò)增結(jié)果[11]，因此本研究首先設(shè)置了范圍較廣的模板濃度梯度進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。其次，Mg2+及Taq聚合酶濃度對熒光標(biāo)記微衛(wèi)星分析體系的影響較大，濃度過高將產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。引物用量或循環(huán)次數(shù)過低將導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物量少，電泳條帶暗淡；一般認(rèn)為引物與模板的比例至少為108︰1才能保證PCR過程中引物與模板退火，而不是模板自身退火[12]；由于不同微衛(wèi)星引物的擴(kuò)增效率及擴(kuò)增特異性有差別，故較難準(zhǔn)確把握PCR循環(huán)次數(shù)，通常30次循環(huán)比較合適；但由于熒光標(biāo)記微衛(wèi)星引物的價格高于普通引物，所以可采用小范圍提高循環(huán)次數(shù)，減少引物量來降低成本，因此本文使用33個PCR循環(huán)。此外減小PCR體系體積也是降低成本的一種策略，但體積過小，一方面可能造成樣本間試劑加入量不均等，擴(kuò)增效果不均一，另一方面由于水分蒸發(fā)，體系中干擾物的影響變得明顯，擴(kuò)增效果不理想，本實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行SSR分析時也證明了此點(diǎn)，因此本文采用10 μL體系。

3.2 熒光法與銀染法檢測效率與成本的比較

早期的DNA聚丙烯酰胺凝膠電泳是應(yīng)用放射性核素標(biāo)記完成的，但該方法操作不便，而且可使用范圍局限于少數(shù)具有放射性核素設(shè)施的單位；其后主要使用銀染法，該方法克服了放射性核素標(biāo)記法的缺點(diǎn)，但銀染法不僅耗時較長，顯色效果有時較難把握，而且，由于正、反單鏈以及未解離的雙鏈都能被染色，常導(dǎo)致一個等位基因產(chǎn)生多個銀染條帶，當(dāng)?shù)任换蛑g差異較小時，常常與之相混雜，難以區(qū)分是來自同一個等位基因的重復(fù)條帶，或者來自不同等位基因的條帶。而且銀染法需從膠板人工讀取數(shù)據(jù)，工作繁瑣，受人的主觀性與誤判影響導(dǎo)致的誤差大。熒光法不僅可以使用計算機(jī)軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)，自動讀出等位基因大小，而且它僅標(biāo)記PCR產(chǎn)物的單鏈、不帶標(biāo)記的反向單鏈不會被檢出，1個等位基因電泳分析結(jié)果通常只顯示唯一一條清亮的條帶，彌補(bǔ)了銀染法等存在的上述不足，是微衛(wèi)星檢測技術(shù)未來的發(fā)展方向之一[13]。正因?yàn)槿绱?，本研究使?2尾大黃魚樣品與3個微衛(wèi)星位點(diǎn)，熒光法較銀染法分別多檢測到1、2、2個目的條帶。

本研究中銀染法與熒光法完成70個SSR反應(yīng)分別需費(fèi)用為18.7元和19.5元，熒光法成本稍高，但銀染法需多一步銀染過程，銀染之后需人工讀取數(shù)據(jù)，效率較低。因此，考慮到時間成本和人工成本，本文建立的熒光法檢測效率是銀染法的 6～10倍，是一種更經(jīng)濟(jì)的分析方法。此外，熒光法費(fèi)用較高的原因在于熒光素標(biāo)記的引物是普通引物價格的 10倍左右，且不宜長期保存。因此，當(dāng)需分析大量的微衛(wèi)星位點(diǎn)時，可以考慮通過采用標(biāo)記通用引物法降低成本[14]。

3.3 fSSR方法的應(yīng)用

微衛(wèi)星標(biāo)記具有在基因組中數(shù)量多、分布較均勻、共顯性遺傳、多態(tài)性高以及PCR擴(kuò)增穩(wěn)定可靠等優(yōu)點(diǎn)，已應(yīng)用在水產(chǎn)生物眾多研究領(lǐng)域。微衛(wèi)星標(biāo)記應(yīng)用的前提是開發(fā)出多態(tài)性高的微衛(wèi)星位點(diǎn)。在大黃魚微衛(wèi)星位點(diǎn)的開發(fā)研究方面，林能鋒等[15]使用 PCR法篩選大黃魚部分基因組文庫，得到 2對穩(wěn)定擴(kuò)增的大黃魚引物；Guo等[6]、 An等[16]與Chang等[17]則使用FIASCO法分別篩選出11對、6對與 11對多態(tài)性較高的大黃魚微衛(wèi)星位點(diǎn)；郝君等[18]采用生物素-磁珠富集方法篩選出30對大黃魚微衛(wèi)星位點(diǎn)；丁少雄等[19]使用6對眼斑擬石首魚的微衛(wèi)星引物成功在大黃魚中進(jìn)行了跨種擴(kuò)增。多態(tài)性較高的微衛(wèi)星標(biāo)記已應(yīng)用在水產(chǎn)生物的遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性分析[20]、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建[21]、分子標(biāo)記輔助育種[22]以及預(yù)測有效群體大小及群體波動[23]等研究領(lǐng)域。

微衛(wèi)星標(biāo)記在水產(chǎn)動物親子鑒定研究中也有較多的應(yīng)用。在斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）中，Jerry等[24]使用 7個多態(tài)性較高的微衛(wèi)星位點(diǎn)成功鑒別出來自 13個家系的個體的親緣關(guān)系；Neff[25]使用11個微衛(wèi)星位點(diǎn)對美國Opinicon湖中幾個藍(lán)腮太陽魚（Lepomis macrochirus）群體后代的系譜關(guān)系進(jìn)行了鑒定；Bentzen等[26]使用多重微衛(wèi)星PCR方法對 14個親本的 135尾大鱗大馬哈魚（Oncorhynchus tshawytscha）成功進(jìn)行了系譜關(guān)系分析與追蹤；Rodzen等[27]使用微衛(wèi)星標(biāo)記分析了157尾高首鱘（Acipenser transmontanus）的親緣關(guān)系，鑒定率超過99%。本文使用6對SSR引物，利用本文建立的fSSR技術(shù)對2個大黃魚混合交配群進(jìn)行親子鑒定分析，鑒定率均超過99%，不僅證明了該技術(shù)在大黃魚系譜追蹤上的可行性，而且為將來更準(zhǔn)確進(jìn)行大黃魚遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、分子標(biāo)記輔助育種、種質(zhì)資源保護(hù)等研究奠定了基礎(chǔ)。

[1] Chistiakov D A, Hellemans B, Volckaert F A M. Microsatellites and their genomic distribution, evolution, function and applications： a review with special reference to fish genetics [J]. Aquaculture, 2006,255： 1-29.

[2] 劉愛平, 胡立憲. 微衛(wèi)星多態(tài)性檢測時銀染法和同位素技術(shù)比較 [J]. 湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 1996, 21(2)：169-171.

[3] Bassam B J, Caetano-Anolles G, Gresshoff P M. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels [J]. Analytical Biochemistry, 1991, 196： 80-83.

[4] Miller K M, Laberee K, Kaukinen K H, et al. Development of microsatellite loci in pinto abalone (Haliotis kamtschatkana) [J].Molecular Ecology Notes, 2001, 1： 315-317.

[5] 朱澤遠(yuǎn), 王亞菊, 施用暉, 等. 熒光標(biāo)記微衛(wèi)星分析人工飼養(yǎng)中華絨螯蟹的遺傳多樣性 [J]. 中國海洋大學(xué)學(xué)報, 2007, 37(4)：591-596.

[6] Guo W, Wang Z Y, Wang Y L, et al. Isolation and characterization of six microsatellite markers in the large yellow croaker(Pseudosciaena cracea Richardson) [J]. Molecular Ecology Notes,2005, 5： 369-71.

[7] 任鵬．雜色鮑和大黃魚微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選 [D]. 廈門： 集美大學(xué),2008.

[8] Wang Z Y, Jayasanka P, Khoo S K, et al. AFLP fingerprinting reveals genetic variability in common carp stocks from Indonesia [J]. Asian Fisheries Science, 2000, 13： 139-147.

[9] Kalinowski S, Taper M, Marshall T. Revising how the computer program CERVUS accommodates genotyping error increases success in paternity assignment [J]. Molecular Ecology, 2007, 16：1099-1106.

[10] 趙廣泰. 大黃魚“閩優(yōu) 1號”選育群體遺傳結(jié)構(gòu)分析及生長相關(guān)性狀的遺傳參數(shù)估計 [D]. 廈門： 集美大學(xué), 2010.

[11] 劉海云, 王敏, 王繼亮, 等. 大豆 SSR技術(shù)反應(yīng)體系的優(yōu)化 [J].華北農(nóng)學(xué)報, 2007, 22(5)： 36-39.

[12] 余艷, 陳海山, 葛學(xué)軍. 簡單重復(fù)序列區(qū)間（ISSR）引物反應(yīng)條件優(yōu)化與篩選 [J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報, 2003, 11(1)： 19-19．

[13] Barnett B, Wike C, Dennis A, et al. High-precision genotyping by denaturing capillary electrophoresis [J]. Genome Research, 1998, 8：69-80.

[14] Schuelke M. An economic method for the fluorescent labeling of PCR fragments [J]. Nature Biotechnology, 2000, 18： 233-234.

[15] 林能鋒, 許斌福, 曾紅. PCR法篩選大黃魚微衛(wèi)星DNA [J]. 福建畜牧獸醫(yī), 2005, 27(2)： 7-8.

[16] An H S, Cho, K C, Park J Y, et al. Eleven new highly polymorphic microsatellite loci in the yellow croaker, Pseudosciaena crocea [J].Molecular Ecology Notes, 2005, 5： 866-868.

[17] Chang Y M, Ding L, Wang W W, et al. Isolation and characterizati--on of 11 microsatellite markers for the large yellow croaker,Pseudosciaena crocea [J]. Conservation Genetics, 2009, 10：1405-1408.

[18] 郝君, 孫效文, 梁利群, 等. 大黃魚微衛(wèi)星標(biāo)記的富集與篩選[J].中國水產(chǎn)科學(xué), 2006, 13： 762-766．

[19] 丁少雄. 分子標(biāo)記在大黃魚遺傳育種及石首魚科分子系統(tǒng)進(jìn)化研究中的應(yīng)用 [D]. 廈門： 廈門大學(xué), 2001.

[20] Was A, Wenne R. Genetic differentiation in hatchery and wild sea trout (Salmo trutta) in the Southern Baltic at microsatellite loci [J].Aquaculture, 2002, 204： 493-506.

[21] Ren G, Stphane M, Kamila T C, et al. A TypeⅠand TypeⅡmicrosatellite linkage map of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)with presump tive coverage of all chromosome arms [J].Genomics, 2006, 7： 12-13.

[22] Fuji K, Kobayashi K, Hasegawa O, et al. Identification of a single major genetic locus controlling the resistance to lymphocystis disease in Japanese flounder (Paralichthys olivaceus) [J].Aquaculture, 2006, 254： 203-210.

[23] Hitoshi A, Robin S W, William R A, et al. Effective population size of steelhead trout： influence of variance in reproductive success,hatchery programs, and genetic compensation between life-history forms [J]. Molecular Ecology, 2007, 16： 953-966.

[24] Jerry D, Evans B, Kenway M, et al. Development of a microsatel--lite DNA parentage marker suite for black tiger shrimp Penaeus monodon [J]. Aquaculture, 2006, 255： 542-547.

[25] Neff B. Genetic paternity analysis and breeding success in bluegill sunfish (Lepomis macrochirus) [J]. Journal of Heredity, 2001, 92：111-119.

[26] Bentzen P, Olsen J, McLean J, et al. Kinship analysis of Pacific salmon： insights into mating, homing, and timing of reproduction[J]. Journal of Heredity, 2001, 92： 127-131.

[27] Rodzen J, Famula T, May B. Estimation of parentage and relatedness in the polyploid white sturgeon (Acipenser transmontanus) using a dominant marker approach for duplicated microsatellite loci [J]. Aquaculture, 2004, 232： 165-182.

Condition exploration and optimization for fSSR system and its application in large yellow croaker Larimichthys crocea for parentage assignment

WU Xiang-wei, LIU Xian-de, WANG Zhi-yong

(Key Laboratory of Healthy Mariculture for East China Sea, Ministry of Agriculture of China, Fisheries College, Jimei University, Xiamen 361021, China)

In this study, the fluorescent labeling microsatellite (fSSR) analysis system was constructed and optimized in larger yellow croaker Larimichthys crocea. Although the cost of the fluorescent method was a little higher than that of the silver-staining method, it was 6～10 times efficient compared with the latter with high resolution and repetition .Furthermore, the parentage assignment rates for two groups of large yellow croaker were both more than 99% using optimized fSSR with six microsatellite loci, which means this technology is very usefull.

fSSR; Larimichthys crocea; paretage assignment; Gel-Scan 3000

Q178.53

A

1001-6932(2011)04-0419-06

2010-11-25；

2011-03-12

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(200903029-4)；國家自然科學(xué)基金項目(30771663)；集美大學(xué)優(yōu)秀青年骨干教師基金（2009C002）。

武祥偉 ( 1984－ )，男，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)動物遺傳育種研究。電子郵箱：wxw9559@gmail.com。

王志勇，教授。電子郵箱：zywang@jmu.edu.cn。