郭守軍 楊永利 張正平

詹懷先 周銀銳 方錦榕

（韓山師范學(xué)院生物系，廣東 潮州 521041）

超聲波輔助提取蜈蚣藻多糖的工藝優(yōu)化研究

郭守軍 楊永利 張正平

詹懷先 周銀銳 方錦榕

（韓山師范學(xué)院生物系，廣東 潮州 521041）

對(duì)蜈蚣藻中可溶性粗多糖的提取工藝進(jìn)行研究。采用單因素試驗(yàn)和L9（33）正交試驗(yàn)研究溫度、超聲處理時(shí)間、提取次數(shù)和超聲波功率對(duì)多糖提取率的影響。結(jié)果表明，超聲波功率是影響蜈蚣藻多糖提取的主要因素，其次是提取時(shí)間，再次是提取溫度；最佳工藝為超聲波提取溫度70℃、超聲處理時(shí)間15min、超聲波功率為450W、提取3次；多糖提取率為62.75%，總糖含量為81%。

蜈蚣藻；多糖；超聲波；提取工藝

蜈蚣藻（grateloupia filicinaC.Ag）為紅藻門(mén)蜈蚣藻科蜈蚣藻屬植物，具有清熱解毒和驅(qū)蟲(chóng)之功效，是中國(guó)東南海域常見(jiàn)的大型藻類［1］。硫酸多糖為蜈蚣藻的主要成分之一，近幾年的研究結(jié)果［2－4］表明，其具有較好的抗凝血、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化等生物活性，顯示出了其具有開(kāi)發(fā)成藥物的潛在價(jià)值。目前，多糖類化合物的提取技術(shù)主要有熱水浸提法、堿提取法、酸提取法、微波提取法和酶提取法［5］。但上述方法存在著提取時(shí)間長(zhǎng)、耗能高、效率低等缺點(diǎn)，而且酸堿處理易破壞多糖的空間結(jié)構(gòu)及活性［5］。如朱良等［6］和郭守軍等［7］曾采用正交試驗(yàn)法分別優(yōu)選常規(guī)熱水提取繁枝蜈蚣藻和蜈蚣藻粗多糖的工藝，提取需要高溫（100℃）和很長(zhǎng)的時(shí)間（2～3h）。

超聲波輔助提取技術(shù)是利用超聲波產(chǎn)生的空化作用來(lái)加大提取過(guò)程中的傳質(zhì)效率，促使細(xì)胞組織中活性成分釋放，以提高活性成分的提取效率和純度［8］。本試驗(yàn)通過(guò)單因素和L9（33）正交試驗(yàn)對(duì)超聲波輔助提取蜈蚣藻多糖的工藝進(jìn)行優(yōu)化，為蜈蚣藻多糖的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

蜈蚣藻：采自廣東省汕頭市南澳島；

葡聚糖T－40：純度大于99.8%，美國(guó)Pharmacia試劑；

其它試劑：均為分析純；

超聲波循環(huán)提取器：HF－2.0B型，北京弘祥隆生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；

粉碎機(jī)：DJ－10A型，上海隆拓儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；

超聲波清洗器：HS3120型，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；

紅外線干燥箱：404－1型，成都廣普科學(xué)儀器有限公司；

可見(jiàn)分光光度計(jì)：WFJ－7200，尤尼柯（上海）儀器有限公司；

真空干燥箱：DZF－6050型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蜈蚣藻多糖提取工藝 干燥粉碎的蜈蚣藻用無(wú)水乙醇、95%乙醇和75%乙醇回流3次；采用超聲波輔助水提醇沉法，料液比1∶100（m∶V），濃縮至原液的約1／10體積，醇沉濃度70%（即30mL濃縮液中加入無(wú)水乙醇70mL）［7］；離心速度3 000r／min（離心15min），真空干燥（40℃）得蜈蚣藻粗多糖，稱重后粉碎過(guò)80目篩。

1.2.2 檢測(cè)計(jì)算方法

（1）蜈蚣藻多糖提取率的計(jì)算：

（2）總糖含量計(jì)算：采用苯酚－硫酸比色法，以葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定蜈蚣藻多糖［9］。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：將20mg標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖用蒸餾水定容至500mL作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖溶液0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8mL分別移入帶刻度的試管中，加蒸餾水至2.0mL。再分別加入6%苯酚溶液1.0mL及濃硫酸溶液5.0mL，靜止10min，搖勻，室溫放置20min后于490nm波長(zhǎng)下進(jìn)行比色（呈色可穩(wěn)定數(shù)小時(shí)），測(cè)光密度，以2.0mL蒸餾水按同樣顯色操作為空白，橫坐標(biāo)為多糖微克數(shù)，縱坐標(biāo)為光密度值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品總糖含量測(cè)定：吸取樣品液1.0mL（相當(dāng)于40μg左右的多糖），按上述步驟操作，測(cè)光密度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。

式中：

P——總糖含量，%；

c—— 標(biāo)準(zhǔn)比色曲線上查得的糖濃度，mg／mL；

V—— 樣品溶液的體積，mL；

W—— 樣品重量，mg。

1.2.3 超聲波輔助提取工藝單因素試驗(yàn)

（1）提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響：料液比1∶100（m∶V），提取溫度60℃，提取功率300W，提取時(shí)間15min，在提取1，2，3，4，5次。考察提取次數(shù)對(duì)蜈蚣藻多糖提取率的影響。

（2）提取溫度對(duì)多糖提取率的影響：提取次數(shù)3次，料液比1∶100（m∶V），提取功率300W，提取時(shí)間15min，在溫度分別為40，50，60，70，80℃條件下進(jìn)行提取，考察提取溫度對(duì)蜈蚣藻多糖提取率的影響。

（3）提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響：提取次數(shù)3次，料液比1∶100（m∶V），提取溫度60℃，提取功率300W，分別提取5，10，15，20，25，30min，考察提取時(shí)間對(duì)蜈蚣藻多糖提取率的影響。

（4）提取功率對(duì)多糖提取率的影響：提取次數(shù)3次，料液比1∶100（m∶V），提取溫度60℃，提取時(shí)間15min，分別在提取功率為200，300，400，450，500W 條件下進(jìn)行提取，考察提取功率對(duì)蜈蚣藻多糖提取率的影響。

1.2.4 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)研究，確定最佳提取工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡聚糖測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)苯酚－硫酸比色法測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖濃度與光密度的關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 葡聚糖的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard Curve of glucan

2.2 超聲波提取的單因素試驗(yàn)

2.2.1 提取次數(shù)的影響 由圖2可知，隨著提取次數(shù)的增加，蜈蚣藻多糖提取率逐漸增高；提取次數(shù)從1次增加到3次時(shí)多糖提取率上升明顯，從3次增加到5次時(shí)上升趨勢(shì)相對(duì)較小。由于本試驗(yàn)中前3次提取的多糖總量占5次提取總量的88.2%，而且隨著提取次數(shù)增多，乙醇用量會(huì)加大，同時(shí)濃縮強(qiáng)度的增加會(huì)導(dǎo)致能耗增大和生產(chǎn)成本的提高，所以提取次數(shù)以3次為宜。

2.2.2 提取溫度的影響 由圖3可知，隨著溫度的提高，蜈蚣藻多糖提取率逐漸增高，40℃到50℃間上升明顯，50℃到80℃間上升趨勢(shì)相對(duì)平穩(wěn)。說(shuō)明提取溫度對(duì)多糖的提取率有較大的影響，綜合考慮，提取溫度以60℃為宜。

2.2.3 提取時(shí)間的影響 由圖4可知，隨著超聲波提取時(shí)間的延長(zhǎng)，蜈蚣藻多糖得率略有提高，5～10min這段時(shí)間多糖得率明顯提高，10min以后趨于平穩(wěn)。綜合考慮，提取時(shí)間以10min為宜。

圖2 提取次數(shù)對(duì)蜈蚣藻多糖提取率的影響Figure 2 Effect of ultrasonic extracting times on the extraction ratio of Grateloupia filicina polysaccharide

圖3 提取溫度對(duì)蜈蚣藻多糖提取率的影響Figure 3 Effect of ultrasonic extracting temperature on the extraction ratio of Grateloupia filicina polysaccharide

圖4 提取時(shí)間對(duì)蜈蚣藻多糖提取率的影響Figure 4 Effect of ultrasonic extracting time on the extraction ratio of Grateloupia filicina polysaccharide

2.2.4 超聲波功率的影響 由圖5可知，隨著超聲波功率的升高，蜈蚣藻多糖得率略有升高，但升高的幅度并不大。超聲波功率從200W上升到300W時(shí)，多糖提取率增加2.4%；而當(dāng)超聲波功率從300W上升到500W時(shí)，多糖提取率的增加幅度僅僅在1.2%～1.5%的范圍內(nèi)波動(dòng)。綜合考慮經(jīng)濟(jì)等因素，選擇超聲波功率為300W。

圖5 超聲波功率對(duì)蜈蚣藻多糖提取率的影響Figure 5 Effect of ultrasonic extracting power on the extraction ratio of Grateloupia filicina polysaccharide

2.3 超聲波提取蜈蚣藻多糖的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)影響蜈蚣藻多糖提取率的主要因素（超聲波功率、提取時(shí)間和提取溫度）進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)（提取次數(shù)均采用3次），正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表1 超聲波提取蜈蚣藻多糖的正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 The level and factors table of the extracting polysaccharide technology from Grateloupia filicina by ultrasonic aiding

表2 正交試驗(yàn)的結(jié)果及分析L9（33）Table 2 Results and anaysis of orthogonal test L9（33）

表3 超聲波提取蜈蚣藻多糖正交試驗(yàn)的方差分析 Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment for ultrasonic extraction of Grateloupia filicina polysaccharide

由表2可知，C因素影響最大，其次是B因素，A因素的影響最??；優(yōu)化水平為A3B2C3，即超聲波提取蜈蚣藻多糖的最佳工藝組合為提取溫度70℃、提取時(shí)間15min、超聲波功率為450W。

由表3可知，三因素（超聲波功率、提取時(shí)間和提取溫度）分別在300～450W、10～20min和50～70℃范圍內(nèi)對(duì)蜈蚣藻多糖提取率均無(wú)顯著性影響。

根據(jù)正交試驗(yàn)得出的最佳提取工藝（超聲溫度70℃，超聲時(shí)間15min，超聲功率450W）進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，其蜈蚣藻多糖得率的平均值為62.75%，高于正交表中任一組合。但在實(shí)際生產(chǎn)中，綜合能耗和生產(chǎn)成本等因素考慮，超聲波輔助提取蜈蚣藻多糖的工藝建議使用A3B1C1，即提取溫度70℃、提取時(shí)間10min、提取功率為300W。

2.4 與常規(guī)熱水提取工藝比較

由表4可知，超聲波輔助提取蜈蚣藻多糖與常規(guī)熱水提取法相比，多糖得率有所升高，但升高的幅度不大，總糖的含量明顯高于熱水提取法。這是由于超聲波提取利用其具有的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)和熱效應(yīng)及許多次級(jí)效應(yīng)（如乳化、擴(kuò)散、擊碎、化學(xué)效應(yīng)等），通過(guò)增大介質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)速度，增大介質(zhì)的穿透力，利于植物多糖的釋放和溶出，以提高植物多糖成分的提取效率［10，11］。此外，超聲波輔助提取法不僅克服了熱水提取法高溫長(zhǎng)時(shí)間所造成多糖的降解和雜質(zhì)的溶出量，而且其機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)能使蛋白質(zhì)變性，因此，超聲波輔助法所得多糖的總糖含量就明顯高于常規(guī)熱水提取法。

表4 不同方法提取蜈蚣藻多糖的得率及總糖含量比較Table 4 Comparisons of yield and total sugar contents of Grateloupia filicina polysaccharide extracted with different methods

3 結(jié)論

（1）超聲波法提取蜈蚣藻多糖方法簡(jiǎn)便，提取時(shí)間短，多糖得率和多糖中總糖含量高，其最優(yōu)化工藝條件為提取溫度70℃，提取時(shí)間15min，超聲波功率450W。在最優(yōu)工藝條件下多糖得率達(dá)到62.7%。

（2）從節(jié)能和時(shí)間效率兩方面出發(fā)，超聲波技術(shù)提取蜈蚣藻多糖具有明顯的優(yōu)勢(shì)，其應(yīng)用前景良好。但是，采用超聲波提取多糖類化合物時(shí)，時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)使大分子的多糖斷裂，提取率反而下降。此外，超聲波的使用會(huì)給環(huán)境帶來(lái)一定的噪聲污染，在其應(yīng)用的裝置上應(yīng)該采取一定的消除噪聲的措施。

（3）提取多糖的方法很多，各有優(yōu)缺點(diǎn)，但是不同提取方法對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)及其功能和生物活性的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，在開(kāi)展多糖提取方法研究的同時(shí)，能兼顧后者，則研究所獲得的最優(yōu)工藝會(huì)更有應(yīng)用價(jià)值。

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Optimizing for the technics of extracting polysaccharide from thegrateloupia filicin awith ultra sonic aiding

GUO Shou－jun YANG Yong－li ZHANG Zheng－ping

ZHAN Huai－xian ZHOU Yin－rui FANG Jin－rong

（Biology Department，Hanshan Normal University，Chaozhou，Guangdong521041，China）

Optimizing technics of extracting polysaccharide fromgrateloupia filicinawas carried on by single factor tests and L9（33）orthogonal experiment by the aid of ultrasonic wave.Experimental result showed that the ultrasonic power was the main factor effecting the extracting rate ofgrateloupia filicinapolysaccharide，extracting time was the secondly factors and extracting temperature thirdly.The optimum technics was as follow：extracting temperature 70℃，extracting time 15min and ultrasonic power 450W.The extraction yield was 62.75%，and the contents of total sugar was 81%.

grateloupia filicina；polysaccharide；ultrasonic；extracting technics

10.3969／j.issn.1003－5788.2011.04.014

廣東省科技廳計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2007B080701046）；韓山師范學(xué)院青年基金（編號(hào)：200502）

郭守軍（1965－），男，韓山師范學(xué)院教授，博士。E－mail：sjguo2006＠yahoo.com.cn

2011－03－20