朱 蘭，何 偉，許書寧，周靜雯

(大連民族學(xué)院環(huán)境資源學(xué)院學(xué)生，遼寧大連 116605)

抗腫瘤的海洋微生物篩選

朱 蘭，何 偉，許書寧，周靜雯

(大連民族學(xué)院環(huán)境資源學(xué)院學(xué)生，遼寧大連 116605)

本研究利用人體宮頸癌細(xì)胞(Hela細(xì)胞)為靶細(xì)胞，在大連近海12種海洋動(dòng)植物體內(nèi)提取微生物。用4種分離培養(yǎng)基培養(yǎng)，分離并得到48株海洋微生物。對(duì)單菌落進(jìn)行發(fā)酵，獲得其次生代謝產(chǎn)物。隨后，進(jìn)行海洋微生物的發(fā)酵次生代謝產(chǎn)物的抗腫瘤鑒定［1－5］，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有1種菌株(12#－從黑泥中用MD培養(yǎng)基篩選的菌)發(fā)酵液對(duì)Hela細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用，6種菌株發(fā)酵液有輕微的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

微生物分離培養(yǎng)材料取自大連近海的海泥、海水、魚類等12種樣品;腫瘤細(xì)胞為Hela細(xì)胞。

1.2 儀器及試劑

儀器:Vs—1300型潔凈工作臺(tái)、28℃RXZ—300B型培養(yǎng)箱、37℃MJ—180B型生化培養(yǎng)箱、MLS—3020高壓滅菌器、ZHWY－221B新型大容量全溫度恒溫培養(yǎng)震蕩器、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)箱。

試劑:葡萄糖、海水、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、SDS、孟加拉紅、胰蛋白胨、蛋白胨、酵母浸膏、可溶性淀粉、胎牛血清等。

1.3 方法

(1)在無菌操作臺(tái)上稱取2～4 g從海邊采集的樣品放入滅菌的小燒杯中，用無菌剪剪碎，無菌量筒稱取10倍的無菌海水，將樣品和海水一起倒入無菌三角瓶中，旋渦振蕩10 min，使其充分混懸制成懸濁液。取8 mL懸濁液于無菌離心管中，取2 次，離心振蕩 10 min，轉(zhuǎn)速為 1 500 r·min－1，離心后，取上清液備用。

(2)稀釋涂布平板法。將上述上清液與無菌陳海水按體積比1∶9 稀釋成10－3，10－4，10－5，10－6質(zhì)量濃度，吸取10 μL，分別放入查氏培養(yǎng)基(Cha)、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NRG)、高氏一號(hào)培養(yǎng)基(G1)、馬丁氏培養(yǎng)基(MD)(分別培養(yǎng)霉菌、細(xì)菌、放線菌、真菌)平板中，用無菌涂布器在培養(yǎng)基表面輕輕涂布，室溫下靜置30 min后置于30℃恒溫培養(yǎng)箱。待菌落長(zhǎng)出后，觀察記錄菌落顏色、透明度、菌落表面、邊緣形態(tài)，檢查其特征是否一致。若發(fā)現(xiàn)有雜菌，需進(jìn)一步分離，純化，直至獲得純菌落。

(3)菌種發(fā)酵。從斜面取活化培養(yǎng)的單菌落適量，分別接種到三角瓶中(每瓶30 mL發(fā)酵培養(yǎng)液)，于28℃振蕩搖床中 120 r·min－1振蕩培養(yǎng)10 d，發(fā)酵液備用測(cè)活。

(4)發(fā)酵產(chǎn)物抗腫瘤活性鑒定。將發(fā)酵液按照1∶50的體積比，即5 mL人體宮頸癌細(xì)胞培養(yǎng)液中放入100 μL的發(fā)酵液(不同時(shí)間取一個(gè)空白對(duì)照)再放入CO2培養(yǎng)箱中測(cè)活。抑制后從CO2培養(yǎng)箱中取出6孔板，用鑷子夾出玻璃片，放在擱物架上晾干，待完全干后進(jìn)行染色。

(5)顯微觀察。在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)特征以及數(shù)目，如細(xì)胞縮小，核質(zhì)固縮聚集，形成小體及吞噬現(xiàn)象等。取附著有發(fā)酵培養(yǎng)液物質(zhì)處的區(qū)域進(jìn)行記數(shù)，用“+”表示抑制的強(qiáng)弱。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品測(cè)定的結(jié)果

篩選的單菌落對(duì)人體宮頸癌細(xì)胞(Hela細(xì)胞)的抑制結(jié)果見表1。

表1 單菌落對(duì)人體宮頸癌細(xì)胞(Hela細(xì)胞)的抑制結(jié)果

2.2 討論

從測(cè)定結(jié)果可以得出:48種單菌株發(fā)酵液中，有一種菌株對(duì)腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用，6種菌珠有輕微的抑制作用，其余菌珠對(duì)腫瘤細(xì)胞沒有抑制作用。

3 結(jié)語

綜上所述，海洋微生物是一個(gè)巨大的尚待開發(fā)的資源。海洋微生物數(shù)量大，種類多，隨著人類對(duì)海洋微生物認(rèn)識(shí)的加深，對(duì)海洋微生物活性物質(zhì)研究的深入，一定可以從中發(fā)現(xiàn)更多高效低毒的海洋微生物抗腫瘤新藥，使海洋微生物活性物質(zhì)為人類做出更大貢獻(xiàn)。

［1］王正平，張慶林，胡艷紅.海洋微生物抗腫瘤活性物質(zhì)的研究進(jìn)展［J］.海洋科學(xué)，2002，26(8):28 －30.

［2］李越中，陳琦.海洋微生物資源及其產(chǎn)生生物活性代謝產(chǎn)物的研究［J］.生物工程進(jìn)展，2000，20(5):28 －31.

［3］李利君，蔡慧農(nóng)，蘇文金.海洋微生物生物活性物質(zhì)的研究［J］.集美大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2000，5(2):80－86.

［4］劉志鴻，程力，牟海津.海洋微生物活性物質(zhì)的研究概況［J］.中國水產(chǎn)科學(xué)，1999，6(4):99－103.

［5］林永成，周世寧，樂長(zhǎng)高.海洋微生物活性代謝產(chǎn)物化學(xué)［J］.大學(xué)化學(xué)，1996，11(6):5.

Q93－33

A

1009－315X(2011)05－0524－02

2011－06－20;最后

2011－07－04

指導(dǎo)教師:姜健(1970－)，男，內(nèi)蒙古通遼人，教授，博士，主要從事細(xì)胞生物學(xué)研究;楊寶靈(1969－)，女，內(nèi)蒙古通遼人，高級(jí)工程師，主要從事生物學(xué)研究。

(責(zé)任編輯 鄒永紅)