趙小菁，田 甜，支 云，范圣第

(大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116605)

偶氮苯類人工受體中間體的合成及1H NMR譜

趙小菁，田 甜，支 云，范圣第

(大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116605)

在一種仿G蛋白耦合型信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的人工超分子系統(tǒng)中引入一類偶氮苯結(jié)構(gòu)的化合物，用來模擬跨膜受體。以苯胺為原料，合成幾種人工受體中間體－偶氮苯化合物，選取其中4，4’－二羧基偶氮苯與谷氨酸甲酯(GluOMe)進(jìn)行連接，得到一種氨基酸甲酯偶氮苯衍生物(Azo－AAOMe)，并對其1H NMR譜進(jìn)行了研究。核磁譜圖顯示，所合成的化合物正是預(yù)期產(chǎn)物。

偶氮苯;人工受體;1H NMR譜

細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程與細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分裂、細(xì)胞代謝、細(xì)胞增殖等緊密相關(guān)。研究細(xì)胞膜上各個重要環(huán)節(jié)蛋白質(zhì)之間的相互作用及生物體系信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中重要分子事件的過程和機(jī)理，一直是生命科學(xué)研究的目標(biāo)［1］?？缒ぜ?xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程與受體蛋白的結(jié)構(gòu)與功能緊密相關(guān)，受體是位于細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的一種糖蛋白或糖脂分子，它能夠選擇性的識別外來信號，并與之結(jié)合，從而激活或啟動一系列生化反應(yīng)，產(chǎn)生特定的生物學(xué)效應(yīng)，通常所說的受體是指膜受體。根據(jù)細(xì)胞膜表面受體信號轉(zhuǎn)換機(jī)制和受體分子的結(jié)構(gòu)特點，細(xì)胞膜表面受體分為激動劑控制的離子通道型受體、G蛋白耦合型受體和酶活性受體三類。

目前G蛋白耦合型和具有酶活性受體型仿生信號轉(zhuǎn)導(dǎo)體系在模型的構(gòu)建方面已經(jīng)有了一些成功的報導(dǎo)［2］。一種在作為細(xì)胞膜模型的人工雙層膜囊泡上使用能穩(wěn)定插入囊泡雙層膜中的合成固醇類化合物為受體，以鄰羥基萘醛為信號分子的仿G蛋白耦合型信號轉(zhuǎn)導(dǎo)超分子體系已經(jīng)被構(gòu) 建［3－4］，如圖1。

圖1 仿G蛋白耦合型信號轉(zhuǎn)導(dǎo)人工超分子體系示意圖

本文試圖在該系統(tǒng)中引入一類含有偶氮苯結(jié)構(gòu)的化合物，用來模擬跨膜受體，可令系統(tǒng)接受光信號刺激后改變受體構(gòu)象從而影響信號分子的傳遞，具體結(jié)構(gòu)如圖2。光致異構(gòu)是指有機(jī)分子通過光的激發(fā)，其分子結(jié)構(gòu)在兩種不同形式之間的可逆轉(zhuǎn)換。近年來國內(nèi)外的不少研究小組利用有機(jī)材料這種性質(zhì)，發(fā)展新型的光器件［5－10］。偶氮苯是一個典型的光致變色分子，在不同波長光照射下，其分子內(nèi)的－N=N－基團(tuán)會可逆地實現(xiàn)順式 － 反式異構(gòu)化［11－12］。

將偶氮苯類化合物引入生物體系的受體結(jié)構(gòu)中，這在國內(nèi)研究中尚屬首次，在化學(xué)生物學(xué)的研究領(lǐng)域具有一定的意義。由于受體的基本結(jié)構(gòu)單元是多肽且人工合成相對較難，所以選取偶氮苯化合物與氨基酸及其衍生物進(jìn)行連接，作一個初步模擬的嘗試，為此我們合成了幾種偶氮苯類人工受體的中間體，合成路線如圖3，并對化合物的1H NMR譜作了研究。根據(jù)核磁譜圖可以判斷所合成的化合物為預(yù)期產(chǎn)物，這為下一步的研究工作奠定了重要的基礎(chǔ)。

圖2 順反偶氮苯結(jié)構(gòu)示意圖

圖3 幾種偶氮苯的合成路線示意圖

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

DF－101S集熱式恒溫磁力攪拌器(河南鞏義市英峪予華儀器廠);HR－200電子天平(OHAUS Adventurer);SHZ－D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(河南鞏義市英峪予華儀器廠);DHG－9070型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備廠);PHS－25 Bench PH/MV METER;Shimazu UV2450紫外－可見分光光度計;IWAKI ASAHI REN－1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;Mercury Vx 300核磁共振儀(300Hz)。試劑均為市售的化學(xué)純或分析純，苯丙氨酸甲酯為實驗室自制。

1.2 4，4’－二羧基偶氮苯的合成

合成方法一:

(1)對碘苯胺的合成:將30 mL水，20 mmol NaHCO3(1.68 g)和9 mmol苯胺(0.92 g)混合，待固體全部溶解后，在激烈攪拌下分批加入10 mmol碘(2.5 g)，室溫下攪拌2 h，過濾，無水乙醇重結(jié)晶，得白色晶體，產(chǎn)率為70%。

(2)4，4’－二碘偶氮苯的合成:將13.7 mmol對碘苯胺(3 g)，3.13 mmol KMnO4(5.1 g)和20.26 mmol CuSO4·5H2O(5.1 g) 溶解于 80 mLCHCl3中，室溫下攪拌 3 d，過濾，粗產(chǎn)品以CH2Cl2為展開劑進(jìn)行提純，產(chǎn)率為15%。

(3)4，4’－二氰基偶氮苯的合成:在25 mL圓底燒瓶中，加入6 mmol4，4’－二碘偶氮苯，0.006 mmolPd(OAc)2，10 mLDMAC，1.2 mmol K4［Fe(CN)6］·3H2O和6 mmolNa2CO3，130℃下N2保護(hù)反應(yīng)1.5 h，結(jié)束后，降至室溫，加入20 mL乙酸乙酯，過濾，依次用15 mL水洗滌2次，15 mL 5%氨水洗滌1次，最后無水Na2SO4干燥，直接進(jìn)入下一步實驗。

(4)4，4’－二羧基偶氮苯的合成:100 mL單口瓶中，加入 14.0 g 乙二醇，0.33 mol水(6.0 g)和0.03 mol對苯甲基苯甲氰(5.8 g)，加熱攪拌，令苯甲氰分散于乙二醇水溶液中，迅速加入NaOH(20.0 g，0.50 mol)，回流3.5 h，冷卻后，反應(yīng)混合物傾入400 mL水中稀釋，濾去白色不溶物，濾液用鹽酸調(diào)節(jié)到pH=2，析出黃色固體，水洗至中性，烘干后乙醇－水重結(jié)晶，產(chǎn)率為60%。

合成方法二:

在500 mL三頸瓶中依次加入38.9 mmol對硝基苯甲酸，625 mmol NaOH(25 g)和120 mL水，溫度控制在50℃。將227.5 mmol葡萄糖(50 g)溶于75 mL的水中，30 min內(nèi)滴入三頸瓶中，維持溫度 50～60℃，反應(yīng) 8 h后停止，冷卻至室溫。混合物用稀醋酸中和至pH=6左右，過濾，水洗，固體用熱碳酸鉀溶解，酸化，析出固體，抽濾，水洗至中性，100℃真空干燥24 h，得到淺黃色固體4.21 g，產(chǎn)率為80%。

1.3 4，4’－羥基偶氮苯的合成

在250 mL的三頸燒瓶中加入0.05 mol對氨基苯酚，12.5 mL 36%的鹽酸溶液，7.5 mL36%的乙酸和37.5 mL水，將三口燒瓶置于冰鹽浴中降溫，待溫度降到5℃以下時，開始用恒壓滴液漏斗滴加30%的亞硝酸鈉水溶液12.5 mL，滴加完畢后，保持溫度5℃以下45 min，溶液顏色呈深紅黑色。反應(yīng)停止后，過量的亞硝酸鈉用尿素除去，得紫紅色重氮鹽。

在另外的三口燒瓶中加入0.05 mol苯酚及12.5 mL水，35℃機(jī)械攪拌0.5 h，開始同時滴加重氮鹽溶液和1.3 mol·L－1碳酸鈉水溶液，保持相同的滴速。全部滴加完畢后，保持35℃繼續(xù)反應(yīng)4 h，pH維持在7～7.5，4 h后將溫度升至60℃，反應(yīng)2 h，溶液呈紫紅色，停止反應(yīng)，用稀鹽酸酸化至pH=2，靜置2 h，水洗過濾，所得紫紅色固體真空干燥2 h，苯重結(jié)晶得紅色固體，產(chǎn)率為70%。

1.4 4，4’－二谷氨酸甲酯偶氮苯(Azo－Glu-OMe)的合成

先稱取0.51 g 4，4’－二羧基偶氮苯，0.50 g HoBt(1－羥基－苯并－三氮唑)，0.76 g EDCHCl(1－乙基－(3－二甲基氨基丙基)羰二亞胺鹽酸鹽)以及50 mL二氯甲烷，放入圓底燒瓶中，0℃下攪拌0.5 h后，再加入0.51 g谷氨酸甲酯和0.59 g NMM(氮甲基嗎啉)，反應(yīng)于室溫下攪拌12 h后停止，旋蒸除去溶劑，得橙紅色固體，用二氯甲烷(V)∶乙醚(V)=1∶0～1∶0.2作梯度淋洗劑，硅膠柱色譜提純后，收集第二帶即為所需產(chǎn)物，產(chǎn)率為65%。

2 結(jié)果與討論

2.1 1H NMR 譜圖1

H NMR譜圖如圖4。GluOMe和Azo－Glu-OMe的化學(xué)位移對比圖如圖5。

圖4 偶氮苯類人工受體中間體的1H NMR譜圖

圖5 GluOMe和Azo－GluOMe的化學(xué)位移對比圖

由圖4可看出，對碘苯胺作為原料合成4，4’－二碘偶氮苯之后，3.675 ppm處的游離氨基峰消失，形成偶氮結(jié)構(gòu)。原先氨基的給電子效應(yīng)變成偶氮基團(tuán)的強(qiáng)烈吸電子效應(yīng)，與其相鄰的苯環(huán)氫所受的屏蔽效應(yīng)大大降低［13］，化學(xué)位移從6.460～6.482變?yōu)?.858 ～7.878 ppm，與碘相鄰的苯環(huán)氫也受到相應(yīng)的影響，從7.395～7.416位移至7.635 ～7.656。進(jìn)一步合成 4，4’－ 二羧基偶氮苯之后，該產(chǎn)物在氯仿中的溶解度極低，因此采用氘代甲醇作為溶劑得到1H NMR譜圖。對氨基苯酚與其產(chǎn)物4，4’－二羥基偶氮苯以及對硝基苯甲酸與其產(chǎn)物4，4’－二羧基偶氮苯，兩者的原料與產(chǎn)物的1H NMR數(shù)據(jù)也具有明顯區(qū)別，如圖4之Ⅲ～Ⅵ所示。對氨基苯酚中的苯環(huán)a，b氫的化學(xué)位移非常接近，是由于其苯環(huán)上兩個取代基均具有強(qiáng)給電子效應(yīng)，但氨基的要大于羥基的，因此將6.625 ～6.647 ppm 歸屬于 a 氫，而 6.578 ～6.601 ppm則歸屬于b氫。當(dāng)形成4，4’－二羥基偶氮苯后，化學(xué)位移相距較遠(yuǎn)。對硝基苯甲酸與其產(chǎn)物4，4’－二羧基偶氮苯則由于硝基和重氮基的拉電子效應(yīng)大于羧基的，所以苯環(huán)a氫處于高場，b氫處于低場。

GluOMe和Azo－GluOMe的1H NMR譜圖及標(biāo)注如圖4之Ⅶ和Ⅷ所示，而圖5所示為反應(yīng)前后兩者的化學(xué)位移對比。可以看出，原料GluOMe反應(yīng)生成Azo－GluOMe后，其在8.715 ppm處的自由氨基⑥的單峰消失，在7.999 ppm處出現(xiàn)了一個酰胺峰，是由于C=O鍵π電子環(huán)流使C=O鍵上下的錐體區(qū)域為屏蔽區(qū)，此時鄰位NH上質(zhì)子氫正處于這個區(qū)域，而其側(cè)面的區(qū)域為去屏蔽區(qū)，因此與氨基相連的次甲基②上的質(zhì)子氫由4.327～4.339 ppm 位移至 4.818 ～4.868 ppm。正是由于處在了鄰位質(zhì)子的側(cè)面區(qū)域，屏蔽效應(yīng)減弱，化學(xué)位移從高場向低場變化。酯基上的甲氧基質(zhì)子氫發(fā)生的變化稍有不同，甲氧基①的化學(xué)位移從3.677 ppm變?yōu)?.683 ppm，而⑤的化學(xué)位移則從3.828 ppm變?yōu)?.811 ppm，這可能是由于谷氨酸甲酯的兩個酯基所處的空間位置有差別所至。與次甲基相連的兩個亞甲基均由低場向高場發(fā)生了位移，分別是亞甲基③從2.413～2.427 ppm 到2.174 ～2.246 ppm 和2.334 ～2.398 ppm，亞甲基④從 2.617 ～2.767 ppm 到 2.496 ～2.589 ppm。這意味著在氨基酸與偶氮苯分子連接在一起之后，共軛體系的增大引起的環(huán)電流效應(yīng)增強(qiáng)，即環(huán)平面上、下的屏蔽效應(yīng)增強(qiáng)，這些質(zhì)子氫受到屏蔽，因此向著高場方向位移［14－15］。

2.2 合成與提純

4，4’－二羧基偶氮苯的合成過程中，選用了兩種方法。方法一是以苯胺為原料，通過一系列轉(zhuǎn)化最后獲得產(chǎn)品，該方法的優(yōu)點是起始原料非常便宜易得，第一步合成步驟十分簡單，但是從第二步開始所需的操作大大增加了難度，產(chǎn)率大大降低。因此，本研究選擇了方法二。原料選用的是對硝基苯甲酸，葡萄糖作為偶合劑，合成步驟同樣十分簡單，最后產(chǎn)率也比較高。需要注意的關(guān)鍵點在于，合成結(jié)束后混合物用稀醋酸中和時所用酸的量必須要掌握好，否則產(chǎn)品極容易流失，導(dǎo)致產(chǎn)率大大降低。4，4’－二羥基偶氮苯的合成同樣要注意最后稀鹽酸中和時對使用的酸量有所控制。

4，4’－二羧基偶氮苯與谷氨酸甲酯是采用EDC縮合法，縮合反應(yīng)的初始階段需在0℃下進(jìn)行，所以在谷氨酸甲酯加入前先控制反應(yīng)在0℃下0.5 h。所得的紅色產(chǎn)物需通過色譜柱進(jìn)行拆分，這只能在實際操作中通過反復(fù)摸索才最后確定淋，洗劑的比例為:二氯甲烷(V)∶乙醚(V)=1∶0，1∶0.1，1∶0.2。之后再通過核磁檢測，確定第二帶為所需產(chǎn)品。

3 結(jié)論

合成了一種新型的氨基酸甲酯偶氮苯化合物，對合成過程進(jìn)行了探索，選取了條件溫和、產(chǎn)率較高的路線，并選取了柱色譜的提純方法，經(jīng)過反復(fù)摸索確定了梯度淋洗劑，并結(jié)合核磁共振波譜確定所需產(chǎn)品。用本方法可方便地擴(kuò)大合成規(guī)模，為偶氮苯化合物與氨基酸連接，甚至與多肽的連接，從而引入受體結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)，這對于實現(xiàn)受體的人工模擬有著重要的意義。

［1］孫大業(yè)，郭艷林，馬力耕，等.細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［M］.北京:科學(xué)出版社，2001.

［2］HANCOCK J T.Cell Signaling［M］.Harlow:Longman，1997.

［3］KIKICHI J，ARIGA K，SASAKI Y，et al.Control of enzymic activity by artificial cell－ surface receptor［J］.J.Mol.Catal.B.，2001，11:977 －984.

［4］TIAN W J，SASAKI Y，F(xiàn)AN S － D，et al.Intermolecular Communication on Lipid Bilayer Membrane［J］.J.Supramol.Chem.2005，17，113－119.

［5］IKEDA T，TSUTSUMI O.Supplementary information accompanies this communication on［J］.Nature＇s website.Science，1995，268:1873－1875.

［6］YU Y，NAKANO M，IKEDA T.Directed bending of a polymer film by light［J］.Nature，2003，425:145 －156.

［7］HUGEL T，HOLLAND N B，CATTANI A，et al.Singlemolecule optomechanical cycle［J］.Science，2002，296:1103－1106.

［8］XIE H，LIU Z，HUANG X，et al.Synthesis and non － linear optical materials［J］.Eur.Polym.J.，2001，37:497－507.

［9］LI Y B，HE Y N，WANG X G.Photoinduced Deformation of Amphiphilic Azo Polymer Colloidal Spheres［J］.J .Am.Chem.Soc.，2005，127(8):2402 －2403.

［10］WANG L，SCHULTZ P G.Expanding the genetic code［J］.Angew.Chem.，2005，44:34 －66.

［11］KUMAR G S，NECKERS D C.Photochemistry of azobenzene － containing polymers［J］.Chem.Rev.，1989，89:1915－1925.

［12］WU N，DEITERS A，CROPP T A，et al.A genetically encoded photocaged amino Acid［J］.J.Am.Chem.Soc.2004，126，14306－14307.

［13］有機(jī)化合物的波譜解析［M］.藥明康德新藥開發(fā)有限公司分析部，譯.上海:華東理工大學(xué)出版社，2007.

［14］ HAASE J，ECKERT D，SIEGEL H，et al.NMR in pulsed high magnetic fields［J］.Physica B.，2004，346:514.

［15］張帆，胡一帆，胡澤宇，超強(qiáng)磁場中核磁共振信號與屏蔽效應(yīng)的理論研究［J］.波譜學(xué)雜志，2010，27(2):230.

Synthesis and1H NMR Property of Azo－benzene Artificial Receptor Intermediate

ZHAO Xiao－jing，TIAN Tian，ZHI Yun，F(xiàn)AN Sheng－di
(College of Life Science，Dalian Nationalities University，Dalian Liaoning 116605，China)

A series of Azo－compounds has been introduced into a G－pro Bio－inspired artificial signal transduction system，to simulating the transmembrane receptor of this system.The photoinduced isomerization of azobenzene between the extended(trans)and compact(cis)conformations has been reversibly triggered by light of two differing wavelengths.Using aniline as the material，a series of azo －benzene artificial receptor intermediate has been prepared.The 4，4’－dicarboxylazobenzene has been combinded with GluOMe，then a amino acid ester azobenzene derivatives has been synthesized.The1H NMR properties of these products have been studied.The results showed that the products are the right compounds.

Azo－benzene;artificial receptor;1H NMR property

O622

A

1009－315X(2011)05－0444－06

2011－03－28;最后

2011－06－22

國家自然科學(xué)基金資助項目(20872013):中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金資助項目(DC10040108)。

趙小菁(1977－)，女，浙江蘭溪人，副教授，博士，主要從事化學(xué)生物學(xué)研究。

(責(zé)任編輯 鄒永紅)