王裔娜

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河南鄭州 450002)

花藥培養(yǎng)過(guò)程中的滅菌與消毒

王裔娜

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河南鄭州 450002)

利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)花藥進(jìn)行組織培養(yǎng)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)了培養(yǎng)基、無(wú)菌室和超凈工作臺(tái)的滅菌方法，論述了工具器皿的消毒過(guò)程，分析了花藥的預(yù)處理與消毒方法，給出了常用消毒劑的使用方法.

花藥;培養(yǎng);滅菌;消毒;溫度

0 引言

植物組織培養(yǎng)是根據(jù)植物細(xì)胞具有全能性的理論，在無(wú)菌條件下，將離體的植物根尖、莖尖、組織、細(xì)胞、胚胎、原生質(zhì)體、懸浮細(xì)胞等在人工配制的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，給予適宜的培養(yǎng)條件，誘發(fā)其產(chǎn)生愈傷組織或潛伏芽或長(zhǎng)成完整的植株的技術(shù).植物組織培養(yǎng)也稱離體培養(yǎng)或試管培養(yǎng).

花是被子植物特有的有性生殖器官，在花中形成有性生殖過(guò)程中的雌、雄生殖細(xì)胞，以繁衍后代，延續(xù)種族，而花藥則是雄蕊的重要組成部分.從結(jié)構(gòu)上看，花藥是由藥壁、藥隔、花粉囊和花粉粒組成.花藥培養(yǎng)是指將完整的花藥接種到培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)形成單倍體再生植株的方法.花藥是幾乎所有植物器官中很好的無(wú)毒部分，因此是進(jìn)行選育優(yōu)良單倍體植株或獲得純系育種材料的最佳選擇.

花藥培養(yǎng)的主要目的是進(jìn)行單倍體育種，縮短育種年限和提高育種效率及獲得純系育種材料.在育種領(lǐng)域中，花藥培養(yǎng)育種已與常規(guī)雜交育種、遠(yuǎn)緣雜交育種、誘變育種以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合，是生物技術(shù)在農(nóng)作物育種中應(yīng)用最廣泛、最有成效的方法之一.但是在花藥培養(yǎng)過(guò)程中，如果控制不好，污染是經(jīng)常發(fā)生的.滅菌和消毒是一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，這個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)出現(xiàn)失誤或者操作不當(dāng)就會(huì)造成花藥培養(yǎng)失敗，前功盡棄.

1 花藥培養(yǎng)基的滅菌

由于花藥培養(yǎng)基在制備過(guò)程中帶有各種雜菌，所以微生物污染開(kāi)始就在培養(yǎng)基中存在.分裝后的培養(yǎng)基應(yīng)立即滅菌，至少應(yīng)該在24 h之內(nèi)完成滅菌工作，常規(guī)方法是采用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌.

1.1 理論滅菌時(shí)間的確定

微生物的濕熱滅菌過(guò)程，其本質(zhì)上就是微生物細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的變性過(guò)程，從這個(gè)意義上講，滅菌過(guò)程應(yīng)遵循單分子反應(yīng)的速度理論［1］，即滿足方程

式中，N表示殘存的活菌數(shù)，t表示滅菌時(shí)間，K表示滅菌速度常數(shù)，也稱反應(yīng)速度常數(shù)，此常數(shù)的大小與微生物的種類與加熱溫度有關(guān)，dN/dt表示活菌數(shù)瞬時(shí)變化速率，即死亡速率.該方程稱為對(duì)數(shù)殘存定律，表示微生物的死亡速率與任一瞬時(shí)殘存的活菌數(shù)成正比.

將(1)式積分，轉(zhuǎn)換得

其中，K表示滅菌速度常數(shù)，t表示理論滅菌時(shí)間，Nt是經(jīng)時(shí)間t后殘存的活菌數(shù)，N0是t=0時(shí)原有活菌數(shù).

在計(jì)算理論滅菌時(shí)間時(shí)首先要注意K值與微生物種類、生理狀態(tài)、外界環(huán)境等有關(guān)系，即K是微生物熱阻的一種表示形式，微生物的熱阻越大，K值越小.其次N0可以參考一般培養(yǎng)基中的活微生物數(shù)為(1－2)× 107個(gè)/mL，Nt通常取0.001個(gè)，即滅菌失敗的概率為1/1 000.最后，理論滅菌時(shí)間只可以用于工程計(jì)算中，在實(shí)踐過(guò)程中，因蒸汽的壓力不穩(wěn)定、蒸汽的流量大小等很多因素影響使得理論滅菌時(shí)間與實(shí)際滅菌時(shí)間有很大差別.可結(jié)合經(jīng)驗(yàn)數(shù)值做適當(dāng)調(diào)整.

1.2 滅菌溫度的選擇

在花藥培養(yǎng)基滅菌過(guò)程中，除了雜菌死亡，還伴隨著花藥培養(yǎng)基成分的破壞.因此必須選擇既能達(dá)到滅菌目的，又能使花藥培養(yǎng)基的破壞降至最低的溫度.

首先，由于微生物的受熱死亡屬于單分子反應(yīng)，根據(jù)文獻(xiàn)［2］，其滅菌速度常數(shù)K與溫度之間的關(guān)系可用阿累尼烏斯公式表示:

其中T表示絕對(duì)溫度，A表示頻率常數(shù)，也稱阿累尼烏斯常數(shù)，E表示微生物死亡活化能，R是氣體常數(shù).E/R表示了微生物受熱死亡時(shí)對(duì)溫度敏感性的度量，它是加熱滅菌操作中十分重要的參數(shù).當(dāng)E與R比值增大時(shí)，微生物死亡速率就會(huì)隨溫度的變化而敏感度增加;反之，敏感度降低.

其次，根據(jù)文獻(xiàn)［3］，當(dāng)滅菌溫度從T1上升到T2時(shí)，滅菌的反應(yīng)速度常數(shù)K值和營(yíng)養(yǎng)成分分解的反應(yīng)速度常數(shù)K'分別從K1、K'1變化到K2、K'2.若用E和E'分別表示殺死微生物的活化能和營(yíng)養(yǎng)成分的活化能，那么由阿累尼烏斯公式可得

由于殺死微生物的活化能E大于營(yíng)養(yǎng)成分的活化能E'，所以隨溫度的升高，滅菌反應(yīng)速度常數(shù)增加的倍數(shù)大于營(yíng)養(yǎng)成分破壞反應(yīng)速度常數(shù)增加的倍數(shù).雖然隨著滅菌溫度上升，微生物死亡的速率會(huì)提高，培養(yǎng)基成分的破壞速率也會(huì)增加，但是微生物死亡的速率增加度會(huì)超過(guò)培養(yǎng)基成分的破壞速率增加度.因此，采用高溫快速滅菌方法，不僅可殺死培養(yǎng)基中的全部有生命的有機(jī)體，而且可減少營(yíng)養(yǎng)成分的破壞.

具體的方法是，把已裝入花藥培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器直接裝入內(nèi)鍋，上面蓋幾張報(bào)紙吸濕.接通電源升溫后，首先要排凈鍋內(nèi)冷空氣，然后在121℃(1.06 kg/cm2或0.105 MPa)下滅菌15～20 min，可完全殺死物品內(nèi)外的微生物、芽孢和孢子.

2 工具器皿的消毒

植物組織培養(yǎng)的主要過(guò)程都是在無(wú)菌條件下進(jìn)行的，在培養(yǎng)過(guò)程中所用到的工具器皿，如花藥培養(yǎng)基、花藥培養(yǎng)瓶、操作工具器械等都必須防止和消除細(xì)菌、真菌、藻類及其他微生物的污染，均需消毒處理.

2.1 接種器械和玻璃器皿、塑料器皿的滅菌

對(duì)于無(wú)菌操作所用的接種器械包括解剖針、解剖刀、槍形鑷和扁頭小鏟等，一般的消毒辦法是把它們先在95%酒精中浸一下，然后再置火焰上灼燒片刻，待冷卻后使用.這些器械不但在每次操作開(kāi)始前消毒，在操作期間還要消毒幾次.接種器皿在操作過(guò)程中，由于直接與外植體接觸，所以必須經(jīng)過(guò)嚴(yán)格滅菌后才能使用.玻璃培養(yǎng)容器常常與培養(yǎng)基一起滅菌.若培養(yǎng)基已先滅菌，而只需單獨(dú)進(jìn)行容器滅菌時(shí)，可采用高壓蒸汽滅菌法，也可將它們置于烘箱中在160℃～180℃下干熱處理3 h.有些類型的塑料器皿也可進(jìn)行高溫消毒.滅菌方法為:在121℃下反復(fù)進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，每次滅菌的時(shí)間不應(yīng)超過(guò)20 min，然后放在干燥箱內(nèi)進(jìn)行干燥.

2.2 蒸餾水和濾紙的滅菌

將不超過(guò)瓶2/3的蒸餾水或?yàn)V紙分別置于三角瓶中，用棉塞密封瓶口，排放在高壓滅菌鍋中，加溫121℃，滅菌20 min.冷卻后即為無(wú)菌水，放在超凈工作臺(tái)上備用.

2.3 組培苗和組培瓶的滅菌處理

花藥組培瓶?jī)?nèi)組培苗的污染會(huì)導(dǎo)致植物組織培養(yǎng)的失敗，凡出現(xiàn)污染的組培苗或外植體一般都不能再用.花藥組培瓶?jī)?nèi)組培苗的污染一般有細(xì)菌污染和真菌污染，或者在同一瓶?jī)?nèi)同時(shí)存在細(xì)菌污染和真菌污染.通常細(xì)菌污染都在接種后2～3 d開(kāi)始出現(xiàn)，真菌污染在接種后3～5 d出現(xiàn).清除污染最好的方法是先將外植體連組培瓶進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，然后把內(nèi)部的外植體連同培養(yǎng)基扔掉，再把瓶子刷洗干凈備用.

3 無(wú)菌操作區(qū)及操作人員的消毒與滅菌

3.1 無(wú)菌室的消毒和滅菌

組培實(shí)驗(yàn)操作必須在無(wú)菌操作室進(jìn)行，紫外輻射是組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室常用的一種物理殺菌手段，因此，無(wú)菌室內(nèi)一般裝備有紫外消毒燈.無(wú)菌室的消毒要在接種前一天的晚上將紫外燈打開(kāi)，消毒12 h后關(guān)閉，即可使用.

3.2 超凈工作臺(tái)的消毒和滅菌

超凈工作臺(tái)又稱潔凈工作臺(tái)，是組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵設(shè)備.在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行操作是最容易感染細(xì)菌等污染物的時(shí)候，如有不慎就會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗，甚至造成一定的經(jīng)濟(jì)損失，因此對(duì)超凈工作臺(tái)的消毒和之后進(jìn)行操作的過(guò)程中都要注意避免污染.組培操作前，用酒精棉球?qū)⒐ぷ髋_(tái)仔細(xì)擦拭兩遍，尤其是潔凈工作臺(tái)的接口處一定要反復(fù)擦拭，操作人員的雙手和兩臂必須徹底洗凈，而且千萬(wàn)不要讓手和手臂越過(guò)敞著口的無(wú)菌容器的上方，防止細(xì)菌、手部死皮等污染物掉進(jìn)容器里.所有敞口的無(wú)菌表面都盡可能放在超凈臺(tái)的遠(yuǎn)后方.打開(kāi)臺(tái)內(nèi)紫外燈15～30 min，然后關(guān)掉紫外燈并打開(kāi)超凈工作臺(tái)風(fēng)機(jī)，20 min后即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作.紫外輻射同樣傷害皮膚，所以在沒(méi)有采取保護(hù)措施的條件下，不要把手伸入開(kāi)著紫外燈的超凈臺(tái)內(nèi).

在植物組培操作過(guò)程中，超凈工作臺(tái)的風(fēng)機(jī)要始終打開(kāi)，形成無(wú)塵無(wú)菌的工作環(huán)境.此外，在每次操作之前，要把實(shí)驗(yàn)材料和在操作中必須使用的各種器械、藥品等先放入臺(tái)內(nèi)，不要中途拿進(jìn)，同時(shí)，臺(tái)面上放置的東西不宜太多，特別注意不要在迎面堆得太高，以致?lián)踝饬?

3.3 接種工作者自身的消毒與滅菌

接種工作者自身的消毒與滅菌分為三個(gè)內(nèi)容，首先是工作人員的工作服和工作帽的消毒，方法是經(jīng)過(guò)紫外線照射25 min以上，這樣才能達(dá)到無(wú)菌的程度;其次是實(shí)驗(yàn)前要用肥皂洗手，把手掌和手臂一起洗干凈，穿好工作服戴好帽子;最后是進(jìn)入超凈工作臺(tái)后要用70%～75%酒精擦拭雙手.

需要注意的是，在滅菌過(guò)程中如果粗心大意，防護(hù)不當(dāng)，有可能造成健康損傷.如次氯酸鈉是一種常用的化學(xué)消毒劑，接觸皮膚會(huì)造成傷害，若是在開(kāi)著紫外燈的情況下使用次氯酸鈉，由于這時(shí)次氯酸鈉會(huì)釋放出游離氯氣，更會(huì)嚴(yán)重?fù)p害健康.

4 花藥的預(yù)處理與消毒

從自然界和室內(nèi)采集的植物器官和組織材料一般都帶有各種微生物，這些污染源一旦進(jìn)入培養(yǎng)瓶中，會(huì)造成培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料污染.因此在花藥組織培養(yǎng)中，無(wú)菌的外植體材料是取得植物組織培養(yǎng)成功的最基本的前提和根本保證，也是組織培養(yǎng)的一大障礙.因此在材料接種培養(yǎng)前必須消毒處理，消毒一方面要求把材料表面上的各種微生物殺滅，同時(shí)又不能損傷或只輕微損傷組織材料而不影響其生長(zhǎng).

4.1 花藥的預(yù)處理

適當(dāng)?shù)念A(yù)處理可以顯著提高花藥的愈傷組織誘導(dǎo)率.常用的預(yù)處理方法是低溫冷藏，具體的處理溫度和時(shí)間長(zhǎng)度因物種而異.但低溫預(yù)處理對(duì)小麥效果不穩(wěn)定，有時(shí)還有負(fù)效果.

4.2 花藥的消毒

通常用于組織培養(yǎng)的花藥，按小孢子發(fā)育時(shí)期要求，實(shí)際上大多沒(méi)有成熟，花藥外面有萼片、花瓣或穎片、稃片保護(hù)著，基本上處于無(wú)菌狀態(tài).但是如果出現(xiàn)附著其上的微生物等污染情況，由于花藥被包在花被里面，很難將其徹底消除，也不容易控制花藥的消毒時(shí)間，為此，我們對(duì)此進(jìn)行研究，取得了較好的效果.

4.2.1 花藥消毒的步驟

①選好所需要的一種或幾種消毒劑，如70%酒精、0.5%新潔爾滅、1%次氯酸鈉等，放好待用;②去除花萼，滴入少許洗潔精，用自來(lái)水沖洗2～4 h;③在無(wú)菌條件下，用70%酒精表面消毒30 s后，再用不同消毒劑繼續(xù)消毒;④用無(wú)菌水清洗4～5次;⑤無(wú)菌試紙吸干花蕾表面水分后，剝掉花瓣取下花藥，立即接種于無(wú)菌培養(yǎng)基上;⑥在溫度為25℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行暗培養(yǎng)，每隔3～5 d觀察記錄一次，直到結(jié)果不再變化為止.

4.2.2 常用的消毒劑

理想的消毒劑的標(biāo)準(zhǔn)是應(yīng)具有消毒效果好易被無(wú)菌水沖洗掉或能自行分解，對(duì)材料損傷小，對(duì)人體及其他生物無(wú)害，來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉.以下列舉幾種常用消毒劑［4］.

①升汞.又稱氯化汞，Hg2+可以與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性，從而殺死菌體.升汞的消毒效果極佳，但其滲透性過(guò)強(qiáng)，易在植物材料上殘留，對(duì)環(huán)境危害大，對(duì)人畜的毒性極強(qiáng).

②酒精.酒精是最常用的表面消毒劑，但是不同濃度的酒精殺菌效果差別很大，10%～20%的酒精無(wú)殺菌作用，70%～75%酒精殺菌效果最好，95%～100%的酒精會(huì)使菌體表面的蛋白質(zhì)凝固，形成一層保護(hù)膜，阻止了酒精的繼續(xù)滲入，殺菌效果大大降低.

酒精具有較強(qiáng)的穿透力，使菌體蛋白質(zhì)變性，殺菌效果好.同時(shí)它還具有較強(qiáng)的濕潤(rùn)作用，可排除材料上的空氣，利于其他消毒劑的滲入.但酒精對(duì)植物材料的殺傷作用也很大，浸泡時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，并且酒精不能徹底消毒，一般不單獨(dú)使用，多與其他消毒劑配合使用.

③次氯酸鈉.次氯酸鈉是一種較好的消毒劑，它可以釋放出活性氯離子，從而殺死菌體.其消毒能力強(qiáng)，不易殘留，對(duì)環(huán)境無(wú)害.但次氯酸鈉溶液堿性很強(qiáng)，對(duì)植物材料也有一定的破壞作用.

④漂白粉.漂白粉的有效成分是Ca(ClO)2，消毒效果很好，對(duì)環(huán)境無(wú)害.它易吸潮散失有效氯而失效，故要密封保藏.

⑤過(guò)氧化氫.也稱雙氧水，消毒效果好，易清除，又不會(huì)損傷外植體，常用于葉片的消毒.

⑥新潔爾滅.這是一種廣譜表面活性消毒劑，對(duì)絕大多數(shù)植物外植體傷害很小，殺菌效果好.

5 結(jié)論

滅菌與消毒是防止微生物污染的最基本的環(huán)節(jié)，是花藥組織培養(yǎng)技術(shù)中一項(xiàng)重要的工作［5］.花藥組培過(guò)程中，針對(duì)不同的物品要采用不同的滅菌和消毒的方法.培養(yǎng)基用常壓或高壓蒸煮等濕熱滅菌、器械采用灼燒滅菌、玻璃器皿及耐熱用具采用干熱滅菌、不耐熱的物質(zhì)采用過(guò)濾滅菌、植物材料表面用消毒劑滅菌、物體表面用藥劑噴霧滅菌、接種室等空間采用紫外線或熏蒸滅菌.

［1］熊宗貴.發(fā)酵工藝原理［M］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2001:82－98.

［2］趙德勝，韓文清，張明斗.培養(yǎng)基滅菌溫度與時(shí)間的選擇［J］.價(jià)值工程，2010(5):205－206.

［3］高平，劉書(shū)志.生物工程設(shè)備［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2006:180－220.

［4］陳建華，王玲，尹桂芳，等.影響魔芋花藥培養(yǎng)褐變因素研究［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，23(2):458－461.

［5］龐海峰，王平，姜策.矮牽牛花藥培養(yǎng)的研究［J］.北方園藝，2007(5):196－197.

Disinfection and Sterilization in Anther Cultivation Progress

WANG Yi-na

(Institute of Horticulture，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China)

By application of plant tissue cultivation technology on cultivation of anther tissue，and combining operation experience，summarizes sterilization method of media，sterile room and ultra clean bench.The sterilization process of vessels and tools is discussed.Furthermore，analyzes method of anther pretreatment and its disinfection，and shows usage of common disinfectants.

anther;cultivation;sterilization;disinfection;temperature

Q944.6

A

1007－0834(2011)03－0047－04

10.3969/j.issn.1007－0834.2011.03.016

2011－04－25

王裔娜(1989—)，女，河南鄭州人，河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院.