戈文東，裴 黎，倪萍婭，徐小玉，楊雪瑩，張 穎

(1．中國(guó)人民公安大學(xué)，中國(guó) 北京 100038;2．公安部物證鑒定中心，中國(guó) 北京 100038)

一種植物物證的DNA提取方法

戈文東1，裴 黎2，倪萍婭1，徐小玉2，楊雪瑩2，張 穎2

(1．中國(guó)人民公安大學(xué)，中國(guó) 北京 100038;2．公安部物證鑒定中心，中國(guó) 北京 100038)

探索從微量植物檢材中提取DNA的有效方法，并嘗試應(yīng)用于法庭科學(xué)實(shí)踐。方法:采用優(yōu)化改良的硅珠法，從10種不同的植物葉子中提取DNA(8種常見(jiàn)植物，2種毒品原植物)。通過(guò)紫外分光光度法、瓊脂糖凝膠電泳、PCR擴(kuò)增及限制性內(nèi)切酶消化對(duì)提取的DNA進(jìn)行檢測(cè);最后以實(shí)際案例中的植物檢材為研究對(duì)象，驗(yàn)證提取方法。結(jié)果:通過(guò)該方法提取的植物DNA純度較高，質(zhì)量較好。PCR擴(kuò)增的條帶清晰、明亮，無(wú)雜帶。結(jié)論:該方法可有效去除次生物質(zhì)對(duì)DNA的干擾，提取的基因組DNA可滿足PCR擴(kuò)增及以PCR為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)需要，可以應(yīng)用于法庭科學(xué)實(shí)踐。

法庭科學(xué);植物物證;DNA提取

隨著科技的發(fā)展和進(jìn)步，非人源生物物證逐漸引起我國(guó)法庭科學(xué)工作者的關(guān)注，而植物物證的分析鑒定就是其中一項(xiàng)比較重要的內(nèi)容。植物物證的鑒定有形態(tài)學(xué)方法和分子生物學(xué)方法，前者要求檢材盡可能完整新鮮，對(duì)鑒定人員則要求有專(zhuān)門(mén)的植物形態(tài)學(xué)知識(shí);而基于DNA分析的分子生物學(xué)方法則不受此類(lèi)限制，有很大的優(yōu)勢(shì)。

DNA的提取是分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)技術(shù)，提取的DNA的純度及結(jié)構(gòu)完整性關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗。目前有多種DNA提取方法:CTAB法、高鹽低PH法、SDS 法，苯酚法和試劑盒法［1～4］以及在此基礎(chǔ)上出現(xiàn)的改進(jìn)優(yōu)化方法等。但對(duì)植物而言，植物的細(xì)胞壁，及其體內(nèi)多酚類(lèi)，多糖等次生物質(zhì)的存在嚴(yán)重干擾高質(zhì)量DNA的提取，而試劑盒法固然可以獲得高質(zhì)量的DNA，但是成本高，不適合進(jìn)行大規(guī)模的提取。因此，我們選取了8種常見(jiàn)植物及2種法庭科學(xué)實(shí)踐中常見(jiàn)的毒品原植物為材料，在硅珠法［5］基礎(chǔ)上進(jìn)行了優(yōu)化改良，建立了一套經(jīng)濟(jì)高效的可用于多種植物微量組織的DNA提取方法，提取的DNA適用于PCR擴(kuò)增及后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

一、材料與方法

(一)材料

竹葉、核桃樹(shù)葉子、梨樹(shù)葉子、梧桐樹(shù)葉子、柿樹(shù)葉子、柳樹(shù)葉子、銀杏樹(shù)葉子均采自中國(guó)人民公安大學(xué)校園內(nèi);桃樹(shù)葉子采自北京植物園。

罌粟葉子、大麻葉子由公安部物證鑒定中心提供。

(二)DNA提取試劑

1M Tris－ Hcl(PH 8．0)、0．5M EDTA(PH 8．0)、酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)均購(gòu)自上海索萊寶生物科技有限公司;λDNA/HindⅢ、DL2000bp DNA Marker:大連TaKaRa公司;2×PCR MasterMix:Promega公司;硅珠:美國(guó)sigma公司;酶切反應(yīng)所用的試劑均為美國(guó)NEB公司生產(chǎn);其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

硅珠溶液:1g硅珠溶于10ml去離子水，靜置2h，棄上清，加入10ml去離子水，再靜置2h，棄上清，最后加10ml溶解硅珠即可。

表1 DNA提取試劑Table 1 DNA extraction solutions

(三)DNA提取步驟

1．取干葉15mg，加5mgPVP和少量石英砂研磨成粉狀轉(zhuǎn)移至1．5mL離心管中。

2．向離心管中加1mL溶液A，震蕩離心后棄上清，此步驟可依據(jù)需要重復(fù)2－3次。

3．加入250μL溶液B，再加45μL溶液C，同時(shí)加入 PK(10mg/mL)10μL、DTT(1mol/L)10μL，反復(fù)顛倒混勻溶液。70℃水浴30min，期間震蕩2－3次。

4．向管中加入 10μL 0．1U/μLRNase，37℃保溫5min。

5．向管中加入三分之一體積的溶液 D，冰浴5min，離心轉(zhuǎn)移上清。

6．加 350μL溶液 E，震蕩 30s，最大轉(zhuǎn)速離心5min，轉(zhuǎn)移上清液到新的離心管。加600ml溶液F混勻。

7．加50μL硅珠懸浮液，室溫靜置10min。以5000rpm離心30s，棄上清(小心操作，以防硅珠被洗脫，導(dǎo)致DNA損失)。

8．加1mL溶液 G，震蕩洗滌，離心10s棄上清(重復(fù)一次)，室溫風(fēng)干硅珠(小心操作，以防硅珠被洗脫，導(dǎo)致DNA損失)。

9．加40μLTE緩沖液震蕩，70℃2min洗脫DNA，離心后，轉(zhuǎn)移38μL上清液到新的離心管，上清液可用于PCR擴(kuò)增及后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

(四)DNA純度及質(zhì)量檢測(cè)

利用紫外分光光度法檢測(cè):取1μLDNA樣品用ddH2O稀釋100倍，在BECKMAN DU600紫外分光光度計(jì)下檢測(cè)DNA的濃度，測(cè)定260、280 nm波長(zhǎng)下的吸收值，根據(jù)A260/A280判斷DNA的純度及濃度。

基因組瓊脂糖電泳檢測(cè):取提取的DNA樣品8μL，加2μL 的溴酚藍(lán)指示劑，0．9%瓊脂糖凝膠(含EB)電泳，電泳結(jié)果如圖1所示。

(五)PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)

PCR擴(kuò)增:采用植物18s通用引物進(jìn)行擴(kuò)增(引物序列如表1所示，由上海生工合成)，擴(kuò)增反應(yīng)在ABI9700擴(kuò)增儀上進(jìn)行，PCR反應(yīng)總體系為25μL，內(nèi)含 PCR master mix 12．5μL，正反引物(10mM/L)各0．5μL，去離子水 10．5μL，模板 DNA1μL。PCR 反應(yīng)循環(huán)程序?yàn)?95℃預(yù)變性5min;94℃變性1min，56℃退火1min，72℃延伸 2min，共 30個(gè)循環(huán);72℃終延伸10min，4℃?zhèn)錂z。

擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè):取擴(kuò)增產(chǎn)物5μL，加 2μL 的溴酚藍(lán)指示劑，1．2%瓊脂糖凝膠(含EB)電泳，電泳結(jié)果如圖2所示。

表2 植物18s通用引物序列［6］Table 2 The universal primer sequences of plant 18s［6］

(六)限制性內(nèi)切酶消化及檢測(cè)

采用EcoR I和Mse I兩種限制性內(nèi)切酶(酶切反應(yīng)所用的試劑均為美國(guó)NEB公司生產(chǎn))對(duì)6種植物基因組DNA進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)體系混勻離心，置37℃酶切7h后，65℃水浴20min使反應(yīng)終止。

消化產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè):取消化液10μL，加2μL的溴酚藍(lán)指示劑，0．8%瓊脂糖凝膠(含EB)電泳，電泳結(jié)果如圖3所示。

表3 酶切反應(yīng)體系Table 3 Restriction digest reaction systerm

二、結(jié)果與分析

(一)DNA純度與濃度

在BECKMAN DU 600上測(cè)定260、280 nm波長(zhǎng)下的吸收值(結(jié)果如表4所示)，紫外分光光度儀檢測(cè)顯示:優(yōu)化硅珠法所提取的DNA，其A260/A280值均大于1．8，說(shuō)明DNA的純度較好，雜質(zhì)去除徹底。

表4 7種不同植物提取的DNA純度及濃度比較Table 2 The comparison of DNA concentration and purity extracted from 10 different kinds of plant

(二)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

基因組凝膠電泳結(jié)果顯示提取的DNA在高分子量區(qū)有清晰明亮的主帶，拖尾帶較少，表明DNA完整，質(zhì)量較好;點(diǎn)樣孔中幾乎無(wú)雜質(zhì)殘留，表明提取過(guò)程中雜質(zhì)去除干凈，DNA純度較高(圖1)。擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠電泳的結(jié)果顯示，擴(kuò)增條帶清晰明亮，無(wú)雜帶及拖尾現(xiàn)象(圖2)，表明優(yōu)化硅珠法提取的DNA非常適用于PCR擴(kuò)增及以PCR為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)研究。酶切消化產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果顯示酶切完全徹底，表明該方法提取的DNA可用于植物RFLP、AFLP等分子遺傳標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)研究。

三、討論

植物DNA提取是植物分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)和前提，也是難點(diǎn)和重點(diǎn)，提取的DNA的純度及結(jié)構(gòu)完整性是進(jìn)行各項(xiàng)后續(xù)研究所必需的條件和關(guān)鍵。植物由于細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的存在及多酚類(lèi)，多糖等次生物質(zhì)的影響，使高質(zhì)量的DNA的提取獲得成為一大難題。因此，我們?cè)诠柚榉ǎ?］基礎(chǔ)上，做了如下優(yōu)化改良:一是在研磨過(guò)程中加入PVP(聚乙烯吡咯烷酮)。多酚類(lèi)物質(zhì)是植物體內(nèi)常見(jiàn)的次生物質(zhì)，極易與 DNA共價(jià)結(jié)合引起褐變，使 DNA失活［8，9］，PVP 是一種聚合物，它與多酚結(jié)合形成一種不溶的絡(luò)合物，因此也能有效地去除酚類(lèi)，但必須在研磨前加入，否則效果甚微。二是溶液A的使用，溶液A實(shí)際上是一種去除多糖的Buffer。多糖也是植物體內(nèi)的常見(jiàn)次生物質(zhì)，也是干擾植物DNA提取的主要物質(zhì)，要獲得高質(zhì)量的DNA，必須去除多糖。不同的植物因其種類(lèi)不同，多糖含量也不相同，故可根據(jù)所提取的植物不同有選擇地使用。三是加入PK和DTT。PK能消化大片段的蛋白分子，使其更容易去除，而DTT也可抑制氧化反應(yīng)，避免褐化。在加入PK和DTT后僅經(jīng)過(guò)一次酚－氯仿－異戊醇的抽提過(guò)程就使A260/A280達(dá)到了1．8。四是以硅珠的形式吸附DNA。硅珠在高濃度促溶劑(如碘化鈉等)存在下能特異結(jié)合DNA［10］。雙鏈的DNA分子一旦被硅珠吸附則以天然狀態(tài)或部分變性狀態(tài)(單鏈)存在，不能用洗脫RNA或碳水化合物等生物大分子的溶劑(如50%乙醇)將其洗脫下來(lái)。但是，經(jīng)水溶性緩沖液(如TE)重新水化后，DNA就可以在硅珠上定量回收。硅珠的使用減少了雜質(zhì)的摻入，并且可依據(jù)檢材量靈活掌控硅珠用量，在加熱洗脫DNA的時(shí)候，硅珠受熱更均勻，洗脫更徹底，減少了DNA損失，但要引起注意的是在加完硅珠后的一系列操作步驟中，要小心謹(jǐn)慎，防止硅珠的流失，減少DNA的損失。。

傳統(tǒng)的植物DNA提取方法多種多樣，主流方法主要有 CTAB 法和 SDS 法兩種［11，12］，基于這兩種方法的改進(jìn)與優(yōu)化方案又是多種多樣，但都是依據(jù)所提取的植物種類(lèi)的不同而做的有針對(duì)性的改良，譬如說(shuō)，CTAB法更適合于多糖含量高的植物，而SDS法更適合于多酚類(lèi)含量高的植物等等［13］。然而不論何種方法，所消耗的樣本量都比較大，實(shí)驗(yàn)周期也較長(zhǎng)，而且不同的植物還要做有針對(duì)性的選擇和優(yōu)化。我們建立的優(yōu)化硅珠法，所使用的試劑價(jià)格低廉，方便易得，比試劑盒法更經(jīng)濟(jì);操作步驟簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)周期為一個(gè)半小時(shí)左右，省時(shí)省力;樣本材料消耗少，僅需要15mg便可得到足夠的高質(zhì)量的DNA用于PCR擴(kuò)增及后續(xù)實(shí)驗(yàn)，并且該方法適用于多種植物基因組DNA的提取。對(duì)于不同的植物可以增加或刪減步驟，比如像罌粟和大麻，多糖含量不高，可減少溶液A的洗滌次數(shù)或者不洗滌，結(jié)果亦不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)步驟的靈活掌握，使得該方法更為便捷省時(shí)。

四、方法應(yīng)用

(一)案例應(yīng)用:

以公安部物證中心現(xiàn)有的大麻案例中的檢材為研究對(duì)象，按上述方法提取基因組DNA，以大麻性別引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增［14］，產(chǎn)物經(jīng)ABI3130遺傳分析儀進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖3所示:

(二)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用:

以公安部物證鑒定中心的大麻標(biāo)本為研究對(duì)象，根據(jù)參考文獻(xiàn)［15］合成STR引物，以提取的大麻基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)ABI3130遺傳分析儀進(jìn)行檢測(cè)，部分STR檢測(cè)結(jié)果如圖4所 示:

五、結(jié)論

我們所建立的植物DNA提取方法操作簡(jiǎn)便快捷，經(jīng)濟(jì)高效，能有效去除次生物質(zhì)對(duì)DNA的干擾，適合于多種植物DNA的提取，得到的DNA能滿足PCR擴(kuò)增及其后續(xù)實(shí)驗(yàn)的分析，在一定程度上可應(yīng)用于法庭科學(xué)實(shí)踐中的植物物證DNA提取。

［1］［11］［13］周延清，楊清香，張改娜．遺傳標(biāo)記與應(yīng)用［M］．北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2008．96～103．

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DF794

A

1008－2433(2011)06－0121－04

2011－08－28

中國(guó)人民公安大學(xué)學(xué)生科研創(chuàng)新項(xiàng)目資助(11LGS002)的研究成果。

戈文東(1987— )，男，河南駐馬店人，中國(guó)人民公安大學(xué)09級(jí)法醫(yī)專(zhuān)業(yè)碩士研究生;裴 黎(1953— )，女，河南新鄉(xiāng)人，公安部物證鑒定中心主任法醫(yī)師，中國(guó)人民公安大學(xué)法醫(yī)遺傳學(xué)碩士生導(dǎo)師，主要從事法醫(yī)遺傳學(xué)的研究和教學(xué);倪萍婭(1986—)，女，浙江富陽(yáng)人，中國(guó)人民公安大學(xué)2010級(jí)法醫(yī)專(zhuān)業(yè)碩士研究生;徐小玉(1983—)，女，江蘇啟東人，公安部物證鑒定中心主檢法醫(yī)師;楊雪瑩(1980—)，女，河北昌黎人，公安部物證鑒定中心主檢法醫(yī)師;張 穎(1978— )，女，河北石家莊人，公安部物證鑒定中心主檢法醫(yī)師。