鐘丹丹,高美華,李偉偉,張 蓓

(基礎(chǔ)研究)

CD59-linker-CD2融合基因真核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建

鐘丹丹,高美華,李偉偉,張 蓓

目的CD59和 CD2都是重要的淋巴細(xì)胞膜表面分子,參與 T細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。文中構(gòu)建 CD59和 CD2融合基因真核表達(dá)系統(tǒng),探討CD59向 T細(xì)胞傳遞信號(hào)的機(jī)制及 CD59與 CD2的相互作用。方法在CD59基因和CD2基因間加入一段柔性鏈接頭(linker)基因序列,構(gòu)建 CD59-linker-CD2融合基因真核表達(dá)系統(tǒng)。利用 RT-PCR法從人 T細(xì)胞白血病細(xì)胞系Jurkat細(xì)胞總 RNA中擴(kuò)增CD59和CD2基因,分別構(gòu)建CD59-T和CD2-T重組克隆載體,經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶酶切后與 p IRES質(zhì)粒進(jìn)行重組,構(gòu)建 p IRES-CD59-linker-CD2融合基因真核表達(dá)系統(tǒng)。結(jié)果測序證實(shí)CD59和CD2基因擴(kuò)增成功;經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶酶切、PCR和測序鑒定表明攜帶 CD59-linker-CD2融合基因的重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。結(jié)論構(gòu)建 CD59-linker-CD2真核表達(dá)系統(tǒng)為在真核細(xì)胞中表達(dá) CD59與 CD2并進(jìn)一步探討其在 T細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用提供了實(shí)驗(yàn)材料。

CD59基因;CD2基因;融合基因;真核表達(dá)載體

0 引 言

抗原提呈細(xì)胞(antigen-presenting cell,APC)和 T細(xì)胞表面都表達(dá)參與細(xì)胞間相互作用的免疫分子,其中有些又稱為共刺激分子。共刺激信號(hào)分子以受體和配體的形式相互結(jié)合,有助于維持和增強(qiáng) T細(xì)胞與APC的直接接觸,并為 T細(xì)胞進(jìn)一步活化提供協(xié)同刺激信號(hào)。CD59廣泛分布于多種組織細(xì)胞表面,并以糖基磷脂酰肌醇 (glycosyl phosphatidyl inositol, GPI)錨著于細(xì)胞膜表面,借 GPI和脂筏參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[1]。CD2分子表達(dá)于大多數(shù)胸腺細(xì)胞和幾乎全部外周 T細(xì)胞,主要行使黏附和活化功能[2]。CD2除作為黏附分子介導(dǎo) T細(xì)胞與 APC或靶細(xì)胞之間的黏附外,還介導(dǎo) T細(xì)胞旁路激活途徑并為效應(yīng) T細(xì)胞提供活化信號(hào)。CD59為 CD2分子的配體之一[3],兩者作為共刺激信號(hào)分子結(jié)合可為 T細(xì)胞活化提供協(xié)同刺激信號(hào)從而參與 T細(xì)胞的活化[4]。本研究采用基因重組技術(shù),以一段柔性肽基因序列作為接頭序列(linker)連接CD59和CD2基因,構(gòu)建重組基因真核表達(dá)系統(tǒng),為進(jìn)一步探討 CD59與CD2在 T細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 p IRES真核表達(dá)質(zhì)粒、大腸埃希菌JM109均由本室保存,質(zhì)粒 PMD-18T Vector購自TaKaRa公司。PCR、RT-PCR引物由上海生工公司合成并測序。DL2000 DNA Marker購自 TaKaRa公司;限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、MluⅠ及 T4 DNA連接酶、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為 Fer mentas公司產(chǎn)品; PCR試劑 SinoBio 2＊Taq MasterMix購自上海新百諾公司,DNA凝膠回收試劑盒 EZgeneTMGel Extraction試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒 EZgeneTMPlasmidMiniprep試劑盒為 Biomiga公司產(chǎn)品。

1.2 p IRES-CD59-linker-CD2重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1.2.1 PCR擴(kuò)增引物與 linker的設(shè)計(jì) 根據(jù) Gen-Bank中CD59和CD2基因序列,利用 Primer Premier 5軟件自行設(shè)計(jì)擴(kuò)增CD59基因和CD2基因的引物,并去除CD59的終止密碼子和CD2的起始密碼子。在CD59上游引物 5′端加入XhoⅠ限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn),在其下游引物 5′端加入含 5個(gè)中性氨基酸殘基的柔性肽基因序列和EcoRⅠ限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。在CD2上游引物 5′端加入EcoRⅠ限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)和含有 5個(gè)中性氨基酸殘基的柔性肽基因序列,在其下游引物 5′端則加入MluⅠ限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。引物序列如下。

CD59的上游引物 (P1):5′-CCGCTCGAGCCGCAGGTTCTGTGGACAATC-3′(劃線部分為XhoⅠ位點(diǎn));下游引物 (P2):5′-CCGGAATTCGCTTCCTCCGCCTC CTGCTGCCAGAAATGGAGTCAC-3′(劃線部分分別為EcoRⅠ位點(diǎn)和 linker)

CD2的上游引物 (P3):5′-CCGGAATTCGGCGGTGGCGGCAGCACAGCAGGGAACAAAGTCA-3′(劃線部分分別為EcoRⅠ位點(diǎn)和 linker);下游引物(P4):5′-CGCACGCGTACCTCATGGAAGTACGGATA-3′(劃線部分為MluⅠ位點(diǎn))

1.2.2 目的基因的擴(kuò)增 從急性 T細(xì)胞白血病細(xì)胞系 Jurkat T細(xì)胞中提取總 RNA,經(jīng) RT-PCR獲得到 cDNA并作為模板,用 P1、P2和 P3、P4兩對引物分別擴(kuò)增CD59和CD2基因。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性 3min,95℃變性 30 s,52℃退火 50 s,72℃延伸 50 s,共 30個(gè)循環(huán),68℃再延伸 7min。擴(kuò)增產(chǎn)物用 15 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定,分別得到符合預(yù)期長度的CD59和CD2片段,切膠后按照DNA凝膠回收試劑盒說明書純化回收擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.3 CD59-T克隆載體與CD2-T克隆載體的構(gòu)建及鑒定 帶 linker的CD59基因的純化擴(kuò)增產(chǎn)物與 P MD-18TVector于16℃按試劑盒說明進(jìn)行連接,同法將帶linker的CD2基因的純化產(chǎn)物與 P MD-18T Vector連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化按 TSS一步法制備的感受態(tài)大腸埃希菌JM109細(xì)胞。通過氨芐青霉素及藍(lán)白斑篩選,隨機(jī)挑取單個(gè)菌落,過夜搖菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。將質(zhì)粒進(jìn)行 PCR及酶切鑒定,并進(jìn)行測序鑒定。

1.2.4 CD59-p IRES表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 利用p IRES質(zhì)粒構(gòu)建重組真核表達(dá)載體,用XhoⅠ和EcoRⅠ分別雙酶切 p I RES質(zhì)粒和測序鑒定正確后的 CD59-T重組質(zhì)粒,用 15 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定,應(yīng)得到 6100 bp左右的 p IRES酶切片段和 410 bp左右的CD59酶切片段,將兩者切膠純化回收后,按照摩爾比 1∶7加入連接反應(yīng)體系,用 T4 DNA連接酶于 16℃進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌JM109。重組質(zhì)粒 CD59-p I RES的篩選及鑒定同CD59-T重組克隆載體。

1.2.5 p IRES-CD59-linker-CD2表達(dá)載體的構(gòu)建將測序鑒定正確后的重組質(zhì)粒 CD2-T與 CD59-p IRES分別用EcoRⅠ和MluⅠ雙酶切后按上述同樣方法進(jìn)行連接,將 CD2與 CD59-p I RES重組質(zhì)粒連接構(gòu)建 p IRES-CD59-linker-CD2重組真核表達(dá)載體,圖 1為載體構(gòu)建示意圖。

1.3 陽性重組質(zhì)粒 p IRES-CD59-linker-CD2的鑒定

1.3.1 重組質(zhì)粒的 PCR鑒定 以重組質(zhì)粒 DNA為模板,用引物 P1和 P2、P3和 P4以及 P1和 P4進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物用 15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定 用XhoⅠ和EcoRⅠ、EcoRⅠ和MluⅠ以及XhoⅠ和MluⅠ分別對重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)15g/L的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3.3 基因序列測定 將經(jīng)過酶切及 PCR鑒定正確的重組質(zhì)粒 p I RES-CD59-linker-CD2由上海生工公司測序鑒定。

2 結(jié) 果

2.1CD59和CD2片段的擴(kuò)增 引物 P1、P2擴(kuò)增的CD59產(chǎn)物為 420 bp條帶,引物 P3、P4擴(kuò)增的 CD2產(chǎn)物為 613 bp條帶,內(nèi)參β-actin為 154 bp,見圖 2。

圖 1 pIRES-CD59-linker-CD2表達(dá)載體的構(gòu)建Figure 1 Construction of the expression vector conta in ing CD59-linker-CD2

圖2 PCR擴(kuò)增CD59和CD2產(chǎn)物Figure 2 Products ofCD59 andCD2 genes by PCR amplification M:DL2000 DNA Marker;1:CD59和β-actin;2:CD2和β-actin

2.2 CD59-T和 CD2-T克隆載體的 PCR及酶切鑒定 從兩者ALB平板中隨機(jī)挑取單克隆白斑各2個(gè),藍(lán)斑各1個(gè),過夜搖菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒,分別行CD59-T質(zhì)粒 PCR和XhoⅠ、EcoRⅠ雙酶切以及 CD2-T質(zhì)粒PCR和EcoRⅠ、MluⅠ雙酶切鑒定,結(jié)果表明 2種克隆載體均構(gòu)建成功,進(jìn)行測序鑒定,見圖 3、圖 4。

圖 3 CD59-T克隆載體的PCR鑒定及酶切鑒定Figure 3 Identification of the CD59-T vector by PCR and enzyme restriction engyme

圖 4 CD2-T克隆載體的PCR鑒定及酶切鑒定Figure 4 Identification of the CD2-T clon ing vector by PCR and digestion

2.3 陽性重組質(zhì)粒 p IRES-CD59-linker-CD2的 PCR及酶切鑒定 陽性重組質(zhì)粒分別用引物 P1和 P2、P3和 P4、P1和 P4進(jìn)行 PCR擴(kuò)增應(yīng)得到 420、613和 1021 bp的片段;分別用內(nèi)切酶XhoⅠ和EcoRⅠ、EcoRⅠ和MluⅠ、XhoⅠ和MluⅠ對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,應(yīng)得到 408、601和 1009 bp的片段。圖示條帶與CD59、CD2及二者的融合基因片段長度相符,表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,見圖 5。

2.4 陽性重組質(zhì)粒的測序結(jié)果 構(gòu)建的重組質(zhì)粒p IRES-CD59-linker-CD2中的 CD59-linker-CD2基因讀碼框長為 1015 bp(含起始密碼子和終止密碼子)。將測序結(jié)果進(jìn)行核酸相似性比對分析,結(jié)果證明重組質(zhì)粒中的CD59基因、CD2基因與 GenBank中的相應(yīng)基因核酸序列同源性均為 99%。

圖 5 陽性重組質(zhì)粒的 PCR鑒定及酶切鑒定Figure 5 Identification of the pIRES-CD59-linker-CD2 recombinant vector by PCR and digestion

3 討 論

CD59是 CD2的天然配體之一,兩者相互作用一方面可增加 T細(xì)胞與靶細(xì)胞間的黏附作用而有助于效靶細(xì)胞間的結(jié)合;另一方面激活 T細(xì)胞并參與其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。Deckert等[5]研究發(fā)現(xiàn):CD59通過 CD2分子與 T細(xì)胞相結(jié)合從而參與 T細(xì)胞與靶細(xì)胞間的黏附作用。Verhagen等[6]根據(jù) CD2細(xì)胞質(zhì)區(qū)缺失突變子發(fā)現(xiàn)該區(qū)含有 2個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列,內(nèi)含數(shù)個(gè)陽離子結(jié)合位點(diǎn),對 CD2的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至關(guān)重要,使CD2途徑中活化的 T細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高,也是細(xì)胞內(nèi)IL-2基因表達(dá)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。在CD59-CD2途徑中與 TCR/CD3途徑相似,活化的 T細(xì)胞可引發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)反應(yīng),包括細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度升高,蛋白激酶 C(protein kinase C,PKC)活化,轉(zhuǎn)錄靜止細(xì)胞中不表達(dá)的IL-2基因,使 T細(xì)胞活化。在靜息或活化的 T細(xì)胞中,CD2途徑刺激細(xì)胞內(nèi)游離 Ca2+升高的水平遠(yuǎn)高于 TCR/CD3途徑,且不受鈣泵負(fù)調(diào)控的影響。據(jù)此認(rèn)為 CD2分子具有Ca2+信號(hào)放大作用[7]。CD59在 T細(xì)胞活化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及行使功能等方面具有至關(guān)重要的作用。這種T細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的減少或缺失可引起 T細(xì)胞活化及信號(hào)傳導(dǎo)的相應(yīng)變化,導(dǎo)致 T細(xì)胞功能低下,甚至處于無反應(yīng)狀態(tài);也使腫瘤患者適應(yīng)性免疫應(yīng)答降低,是腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視的可能原因,影響其 T細(xì)胞功能恢復(fù)。對 T細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的深入研究提供了大量實(shí)驗(yàn)依據(jù),具有重要的理論價(jià)值。

將不同的目的基因連接起來的一段適當(dāng)長度的核苷酸序列稱為接頭序列 (linker)[8],在基因融合技術(shù)用于合成具有新功能的蛋白質(zhì),并可顯著提高蛋白質(zhì)的某些生物學(xué)特性[9]。在構(gòu)建融合基因真核表達(dá)載體時(shí),我們在CD59與CD2 2個(gè)基因間插入一段由10個(gè)中性氨基酸甘氨酸(Gly)和絲氨酸(Ser)組成的柔性肽編碼基因。這段柔性肽易于彎曲且具有一定的彈性,能保證 2種蛋白質(zhì)的正確折疊。

本研究將擴(kuò)增得到的CD59和CD2基因?qū)胝婧吮磉_(dá)質(zhì)粒 p I RES中來構(gòu)建重組質(zhì)粒,經(jīng)限制性酶切分析、PCR及測序鑒定證明已成功構(gòu)建了含CD59和CD2雙基因的 p I RES-CD59-linker-CD2真核表達(dá)系統(tǒng)。目前尚未見有 CD59與 CD2融合基因構(gòu)建的報(bào)道。本研究構(gòu)建的重組質(zhì)粒為進(jìn)一步從分子水平研究 CD59-linker-CD2的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)活性,闡明其在T細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的協(xié)同作用[10]提供了實(shí)驗(yàn)材料,并為基因靶向治療[11]的臨床應(yīng)用提供了新思路。

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Construction of a eukaryotic expression vector containing CD59-linker-CD2 fusion gene

ZHONGDan-dan,GAO Mei-hua,L IWei-wei,ZHANGBei
(Departm ent of Imm unology,Q ingdao University Medical College,Q ingdao266071,Shandong,China)

ObjectiveBoth CD59 and CD2 are importantmolecules on the surface of lymphocytes and involved in T cell signal transduction.The purpose of this studywas to construct a eukaryotic expression vectorof theCD59 andCD2 fusion gene to facilitate the investigation of the mechanis m of signal transduction from CD59 to T cells and the interaction be tween CD59 and CD2. Methods We constructed a eukaryotic expression vector of the CD59-linker-CD2 fusion gene by linking theCD59 andCD2 geneswith a flexible chain(linker).TheCD59 andCD2 geneswere cloned by RT-PCR from the totalRNA of Jurkat T cells to establish CD59-T andCD2-T cloning vectors,respectively,which in turn were cloned into the plasmid p IRES following restriction endonuclease digestion to construct a eukaryotic vector containing the CD59-linker-CD2 fusion gene.ResultsDNA sequencing confirmed the successful amplification of theCD59 andCD2 genes.Restriction endonuclease digestion,PCR and DNA sequencing analysis proved that the eukaryotic expression vector containing the CD59-linker-CD2 fusion gene was constructed correctly.ConclusionThe successful construction of the eukaryotic expression vector containing the CD59-linker-CD2 fusion gene has prepared the experimental ground for further study of the expressions of CD59 and CD2 in eukaryotic cells and their role in T cell signal transduction.

CD59 gene;CD2 gene;Fusion gene;Eukaryotic expression vector

R392.12

A

1008-8199(2011)01-0015-05

國家自然科學(xué)基金(30972677)

266071青島,青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室[鐘丹丹 (醫(yī)學(xué)碩士研究生)、高美華、李偉偉、張 蓓]

高美華,E-mail:meihuagao@yahoo.com.cn

2010-05-24;英文編輯:2010-06-21)

(責(zé)任編輯:齊 名;英文編輯:李曉軍)