熊 澤 徐紅霞 邵 偉 李 嘯 胡 濱 仇 敏

(1.三峽大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,湖北宜昌 443002;2.湖北民康制藥有限司,湖北宜昌 443002)

鼻淵丸收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第六冊(cè)第202 頁(yè),該方是由蒼耳子、辛夷、金銀花、茜草、野菊花五味藥材制成的復(fù)方制劑,具有祛風(fēng)宣肺、清熱解毒、通竅止痛之功效,臨床用于鼻塞鼻淵,通氣不暢,流涕黃濁,嗅覺(jué)不靈,頭痛,眉棱骨痛.2006 年根據(jù)國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)提高行動(dòng)計(jì)劃中成藥品種增修訂項(xiàng)目任務(wù)表要求,本研究在制定鼻淵丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)過(guò)程中,對(duì)照《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第六冊(cè)第202 頁(yè)中“鼻淵丸”一章,對(duì)“鼻淵丸”質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了修訂及提高.中藥成方制劑第六冊(cè)中對(duì)該藥僅有顯色反應(yīng)和丸劑通則檢查,為保證藥品療效,有必要建立定量分析方法,以便更好地控制藥品質(zhì)量.本研究對(duì)其處方中各味藥材進(jìn)行了鑒別、分析,其主藥蒼耳子中主要含有脂肪油,而油類所含成份比較復(fù)雜,一種揮發(fā)油中常常含有幾十種到一、二百種成份,故不易做定量分析,而其另一主要成份辛夷,本研究在參考2005 年版《中國(guó)藥典》一部的基礎(chǔ)上,探索用HPLC 方法測(cè)定其活性成份木蘭脂素含量的方法,取得很好的結(jié)果.在薄層鑒別方面,制定出藥方中主藥辛夷、蒼耳子、金銀花、野菊花的薄層鑒別方法[1].

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

烘箱(DHP-781 型,湖北省黃石市醫(yī)療器械廠生產(chǎn)),紫外燈(365 nm ,上海科藝光學(xué)儀器廠生產(chǎn)),點(diǎn)樣器(25 μL,上海安亭微樣進(jìn)量器廠生產(chǎn)).

日本島津液相色譜儀:泵LC-10A T ;檢測(cè)器SPD-M10VP;乙睛為色譜純,四氫呋喃,甲醇、乙醇為分析純,水為重蒸餾水.

鼻淵丸(批號(hào)為060301、060302、060303)由湖北民康制藥有限公司提供.

木蘭脂素對(duì)照品(批號(hào):882-200102),綠原酸對(duì)照品(批號(hào):110753-200413),兩種對(duì)照品均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供.

1.2 定性鑒別方法

1.2.1 辛夷

取本品3.0g,研成細(xì)粉,加乙酸乙酯30mL,浸泡20 min 后,超聲處理10 min,濾過(guò),濾液蒸干,殘?jiān)蛹状? mL 使溶解,作為供試品溶液.取辛夷花對(duì)照藥材0.5 g ,同法制成對(duì)照藥材溶液.另取木蘭脂素對(duì)照品,加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液,作為對(duì)照品溶液.照薄層色譜法(中國(guó)藥典2005 版一部附錄V I B)試驗(yàn),吸取上述三種溶液各5 μL ,分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上,以二氯甲烷-乙酸乙酯(9 ∶1)為展開(kāi)劑,展開(kāi),取出, 晾干, 噴以10%硫酸乙醇溶液, 在90 ℃加熱至顯色清晰.

1.2.2 蒼耳子

取本品適量,研細(xì),稱取5 g,加甲醇30 mL,超聲處理30 min,濾過(guò),濾液蒸干,殘?jiān)铀m量使溶解,加于已處理好的D101 型大孔吸附樹(shù)脂柱(內(nèi)徑10 ～15 mm ,濕法裝柱5 cm,水50mL 預(yù)洗)上,先用水100 mL 洗脫,棄去水洗液,再用20%甲醇100 mL 洗滌,收集甲醇洗脫液,蒸干,殘?jiān)蛹状? mL 使溶解,作為供試品溶液.另取蒼耳子對(duì)照藥材2 g,加50%甲醇40 mL 回流提取2 h,濾過(guò),濾液蒸干,殘?jiān)蛹状?0 mL 微熱使溶解,濃縮至約2 mL ,濾過(guò),濾液作為對(duì)照藥材溶液.照薄層色譜法(中國(guó)藥典2005 年版一部附錄VI B)試驗(yàn),吸取上述兩種溶液各10 μL,分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G 薄層板上,以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水-甲酸(3 ∶10 ∶2 ∶2 ∶2)的下層溶液(2 ～10 ℃放置過(guò)夜)為展開(kāi)劑,展開(kāi),取出,晾干,置碘蒸氣中顯色.

1.2.3 金銀花、野菊花

取本品細(xì)粉5 g,用水濕潤(rùn),加醋酸乙酯20 mL ,超聲處理5 min,棄去醋酸乙酯液,殘?jiān)浴凹哟姿嵋阴?0 mL”起同法重復(fù)處理1 次,殘?jiān)尤? mol/L 鹽酸5 滴,加醋酸乙酯20mL,超聲處理5 min,取醋酸乙酯液,殘?jiān)浴凹哟姿嵋阴?0 mL”起同法重復(fù)處理2次,合并醋酸乙酯液,蒸干,殘?jiān)?mL 乙醇溶解,作為供試品溶液.另取綠原酸對(duì)照品,加乙醇制成每1 mL 含0.5 mg 的溶液,作為對(duì)照品溶液.照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2005 年版一部附錄VIB)試驗(yàn),吸取上述兩種溶液各1 μL ,分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(1 ∶15 ∶1 ∶1 ∶2)的上層溶液為展開(kāi)劑,展開(kāi),取出,晾干,置紫外光燈(365 nm)下檢視.

1.3 HPLC法測(cè)定木蘭脂素含量

1.3.1 色譜條件

色譜柱COSM OSIL PACKED COLUM N for HPLC C18 250*4.6 mm ,5 μm;流動(dòng)相:乙睛-四氫呋喃-水(38 ∶2 ∶62)[2-3];流速1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm;進(jìn)樣量10 μL .

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取在60 ℃減壓干燥至恒重的木蘭脂素對(duì)照品適量,加甲醇制成每1 mL 含木蘭脂素15 μg 的溶液,即得對(duì)照品溶液.

1.3.3 供試品溶液制備[4-5]

取重量差異項(xiàng)下本品,研細(xì),取約5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加甲醇25 mL, 密塞, 稱定重量,超聲處理20 min,放冷,再稱定重量,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過(guò),精密量取續(xù)濾液5 mL,加于中性氧化鋁柱(100-200 目2 g,內(nèi)徑10 mm,濕法裝柱,用甲醇預(yù)洗)上,用甲醇洗脫,收集洗脫液,置25 mL 量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò),即得供試品溶液.

1.3.4 陰性對(duì)照溶液的制備

按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中處方比例配成缺辛夷藥材的樣品,然后按供試品溶液的制備方法,制成陰性對(duì)照溶液.

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密稱取在60 ℃減壓至恒重的木蘭脂素對(duì)照品15 mg,用甲醇溶解并定容至100mL(0.15 mg/mL)搖勻,再分別精密量取1 mL ,4 份,制成5 個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0.006 04,0.015 10,0.030 20,0.075 50,0.151 0mg/mL),分別精密吸取上述各溶液10μL,按色譜條件測(cè)定峰面積,以峰面積積分值為縱坐標(biāo),木蘭脂素的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo),繪制曲線,計(jì)算得回歸方程.

1.3.6 回收率試驗(yàn)

采用加樣回收法精密稱取5 g 已知含量、同一批號(hào)鼻淵丸(重復(fù)性試驗(yàn)樣品0.32 mg/g)粉末6 份,分別加入對(duì)照品(0.2 mg/mL)各8.0 mL,按供試品溶液制備和樣品測(cè)定項(xiàng)下方法操作,用1.3.1 色譜條件測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表2.

1.3.7 樣品測(cè)定

精密稱取以下10 個(gè)批號(hào)濃縮鼻淵丸粉末5.0 g,按供試品溶液的制備和樣品的測(cè)定項(xiàng)下方法操作測(cè)定,在上述色譜條件下,對(duì)十批樣品進(jìn)行測(cè)定,以確定本品木蘭脂素含量下限.

2 結(jié)果與分析

2.1 定性鑒別結(jié)果

2.1.1 辛夷

供試品色譜圖中,在與對(duì)照藥材、對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn).Rf 值較好.陰性對(duì)照液無(wú)對(duì)應(yīng)斑點(diǎn),如圖1 所示.

圖1 辛夷TLC 鑒別

2.1.2 蒼耳子

供試品色譜圖中,在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn).Rf 值較好.陰性對(duì)照液無(wú)對(duì)應(yīng)斑點(diǎn),如圖2 所示.

圖2 蒼耳子T LC 鑒別

2.1.3 金銀花、野菊花

供試品色譜圖中,在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的熒光斑點(diǎn).Rf 值較好.陰性對(duì)照液無(wú)對(duì)應(yīng)斑點(diǎn),如圖3 所示.

圖3 金銀花、野菊花T LC 鑒別

2.2 木蘭脂素含量測(cè)定(HPLC法)

由圖5 樣品HPLC 圖知,木蘭脂素主峰與周?chē)鞣彘g分離度大于2,且峰形對(duì)稱,理論塔板數(shù)在6 000 以上,陰性實(shí)驗(yàn)無(wú)干擾.

2.2.1 線性關(guān)系考察

結(jié)果見(jiàn)表1,以峰面積積分值為縱坐標(biāo),木蘭脂素的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo),繪制曲線(見(jiàn)圖4)計(jì)算得回歸方程:Y =640 076.44X -3 888.08,r=0.999 9,表明木蘭脂素在0.060 4 ～1.510 0 μg 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系.

表1 進(jìn)樣量與峰面積對(duì)應(yīng)關(guān)系

圖4 線性關(guān)系考察

圖5 樣品H PLC 圖

2.2.2 精密度試驗(yàn)

取木蘭脂素對(duì)照品溶液,重復(fù)進(jìn)樣6 次,記錄峰面積為164 390、165 436、163 329、165 859、163 430、166 478,結(jié)果RSD 為0.79%.

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同批丸劑磨碎,精密稱取適量6 份,按供試品溶液制備項(xiàng)下方法處理,按上述色譜條件分析測(cè)定,結(jié)果為0.325 3、0.320 7、0.320 4、0.321 5、0.322 1、0.320 1(mg/g),RSD 為0.6%.

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一對(duì)照品溶液,在0,4,8,16,24 hr 分別進(jìn)樣,記錄峰面積為144 923、143 756、145 287、145 641、143 835,RSD 為0.6%.

2.2.5 回收率試驗(yàn)

結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.2.6 樣品測(cè)定

結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 10 批樣品的木蘭脂素含量測(cè)定(n=2)

根據(jù)10 批樣品含量測(cè)定數(shù)據(jù)及藥材的藥典標(biāo)準(zhǔn),制訂本品含量限度為:本品每克含辛夷以木蘭脂素(C23H28O7)計(jì),不得少于0.24 mg .即本品每丸含辛夷以木蘭脂素(C23H28O7)計(jì),不得少于0.048 mg .

3 討 論

鼻淵丸中木蘭脂素含量分析由于存在多種藥材成分,其測(cè)定的干擾較大,進(jìn)而影響到色譜條件的選擇.在本研究擬定的色譜條件下,鼻淵丸中木蘭脂素峰與其它成分的峰能有效的分離,分離度及精密度均符合《中國(guó)藥典》要求,重現(xiàn)性及線性關(guān)系良好,回收率達(dá)標(biāo),故本法可行.

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[5] 楊曉潁.高效液相色譜法測(cè)定鼻淵丸中木蘭脂素含量[ J] .中國(guó)藥業(yè), 2004,13(8):40.