王艷果，傅經(jīng)國，郭利兵

（河南科學(xué)院化學(xué)研究所，河南 鄭州450002）

交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的制備工藝研究

王艷果，傅經(jīng)國，郭利兵

（河南科學(xué)院化學(xué)研究所，河南 鄭州450002）

以細(xì)菌發(fā)酵透明質(zhì)酸（HA）為原料，在室溫條件下采用二乙烯基砜（DVS）交聯(lián)劑制備DVS-HA凝膠，為去除未反應(yīng)的交聯(lián)劑進(jìn)行多方案實驗，通過氣相色譜法檢測凝膠中殘留交聯(lián)劑含量，以期獲得較優(yōu)工藝方案，為進(jìn)一步開發(fā)HA臨床應(yīng)用產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ)。

交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉;二乙烯基砜;氣相色譜法

透明質(zhì)酸（hyaluronic acid HA）是一種從動物組織提取的天然陽離子多聚糖，是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖交替排列構(gòu)成的長鏈高分子，具有良好的親水性、黏彈性、潤滑性。但在臨床醫(yī)學(xué)中發(fā)現(xiàn)天然HA易被生物降解，硬度和力學(xué)強(qiáng)度不夠大，限制了HA的應(yīng)用[1]。將天然HA進(jìn)行交聯(lián)可得更大交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的衍生物，其化學(xué)和力學(xué)性能比HA更穩(wěn)定且具有生物相容性和生物降解性，對人體無毒、無刺激作用，大大拓寬了HA的臨床應(yīng)用領(lǐng)域，尤其是獲得新型醫(yī)用生物材料方面，如防術(shù)后粘連材料、軟組織填充材料、新型藥物緩釋基質(zhì)、美容和整形填充物等[2]。

使用二乙烯基砜（DVS）作為交聯(lián)劑制備HA衍生物是眾多制備交聯(lián)HA的方法之一。早在20世紀(jì)80年代，Balazs成功制備得到了交聯(lián)HA凝膠。但是，DVS-HA凝膠中可能殘留有交聯(lián)劑DVS，而DVS是對機(jī)體有害的物質(zhì)，是引起臨床不良反應(yīng)的主要成分，不利于應(yīng)用于生物體內(nèi)，所以必須對其進(jìn)行去除[3~4]。本文通過不同實驗方案去除交聯(lián)劑DVS，對其工藝技術(shù)進(jìn)行探討研究，作為開發(fā)HA臨床應(yīng)用產(chǎn)品的基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1．1 儀器和試劑

Angilent7890A GC，0．22μm 針頭過濾器，電子天平，98-1型磁力攪拌器。發(fā)酵法生產(chǎn)的透明質(zhì)酸鈉（HA，醫(yī)用輔料級），二乙烯基砜（含量99%）;乙醇、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉均為分析純。

1．2 DVS-HA凝膠的合成

將透明質(zhì)酸鈉 0．5g 溶解到 12．5mL 0．2mol·L－1NaOH溶液中獲得4%（w／v）的溶液，室溫攪拌1h，溶液均質(zhì)透明。稱取一定量DVS加水稀釋至0．5mL，將其加入透明質(zhì)酸堿溶液，迅速攪拌，室溫下反應(yīng)1h得粘稠狀凝膠。反應(yīng)式如下:

1．3 凝膠后處理

1．3．1 方案一

將凝膠在 80mL 磷酸鹽緩沖溶液（0．01mol·L－1，p H 7．0）中溶脹 48h，過濾除去緩沖溶液，用 40mL水洗滌2次，再用80mL等滲磷酸鹽緩沖溶液（0．01mol·L－1，pH7．0）浸泡至凝膠透明均質(zhì)，過濾，水沖洗得透明質(zhì)酸鈉水凝膠。

1．3．2 方案二

將凝膠在 80mL 磷酸鹽緩沖溶液（0．01mol·L－1，pH 7．0）中溶脹 24h，過濾除去緩沖溶液，用 40mL水洗滌2次，再用3倍體積95%乙醇洗滌凝膠變?yōu)樾鯛畛恋?，過濾后用磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次，除去殘留乙醇，然后用80mL生理鹽水浸泡至凝膠透明均質(zhì)，過濾得透明質(zhì)酸鈉水凝膠。

1．3．3 方案三

將凝膠用 0．02mol·L－1鹽酸溶液洗滌至中性，再用3倍體積95%乙醇洗滌，凝膠變?yōu)樾鯛畛恋?，過濾，反復(fù)洗滌2~3次，取每次乙醇上清液，用0．22μm針頭過濾器過濾，取濾液進(jìn)行氣相檢測，DVS殘留量合格后停止洗滌。過濾得白色絮狀沉淀，除去殘留乙醇，得交聯(lián)透明質(zhì)酸干粉。稱取干粉質(zhì)量按含量要求加入生理鹽水浸泡至透明均質(zhì)得透明質(zhì)酸鈉水凝膠。

1．3 氣相檢測

參照文獻(xiàn)[5]方法進(jìn)行氣相色譜法檢測。稱取1g水凝膠，加入4mL乙醇，攪拌凝膠變?yōu)樾鯛畛恋?，取上清液，?．22μm針頭過濾器過濾，取濾液裝入試劑瓶自動進(jìn)樣進(jìn)行檢測。按外標(biāo)法以峰面積計算樣品中DVS殘留量。

2 結(jié)果與討論

由于交聯(lián)劑DVS在水和乙醇中具有很強(qiáng)的溶解能力，所以溶脹步驟既可以使凝膠的pH穩(wěn)定也可以去除殘留的DVS。通過上述實驗可以看出:方案一比較簡單易行，但是需要長時間浸泡才能使凝膠中的DVS殘留量達(dá)到要求;根據(jù)HA以及DVS-HA在乙醇中不溶解的性質(zhì)，方案二與三用乙醇沉淀法很容易去除殘留DVS，同時也需要去除乙醇，形成凝膠必須滿足乙醇?xì)埩袅恳螅ú淮笥?400μg·g－1），增加了檢測步驟，與方案一相比，步驟相對繁瑣一些;方案三與方案二比較，優(yōu)點是形成干粉容易保存，同時也可以按含量要求進(jìn)行浸泡。

通過多方案實驗，初步篩選方案一作為DVSHA凝膠制備的較優(yōu)工藝，但是HA臨床應(yīng)用產(chǎn)品的開發(fā)還需要兼顧考慮其他因素，如流動性和可注射性等。

[1] 楊好，熊文說，應(yīng)國清，等．交聯(lián)透明質(zhì)酸衍生物的制備與應(yīng)用進(jìn)展[J]．化工進(jìn)展，2006，25（12）:1410-1414．

[2] 陳景華，林樅，顧其勝，等．制備透明質(zhì)酸衍生物交聯(lián)劑的應(yīng)用研究 [J]．中國修復(fù)重建外科雜志，2004，18（1）:70-73．

[3] 葛翠蘭，顧其勝．交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠中交聯(lián)劑的HPLC測定[J]．上海生物醫(yī)學(xué)工程，2006， 27（4）:223-225．

[4] 陳拓成，陳麗夙．交聯(lián)透明質(zhì)酸的制造方法[P]．CN 101724164A，2010-06-09．

[5] 朱彬，葛翠蘭，顧其勝．氣相色譜法檢測交聯(lián)透明質(zhì)酸中交聯(lián)劑殘留量 [J]．生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)進(jìn)展，2008，29（1）:26-28．

Preparation Technology of Crosslinked Sodium Hyaluronate Gels

WANGYan-guo， FUJing-guo，PANGShi-yi
（Institute of Chemistry， Henan Academy of Sciences， Zhengzhou 450002）

The HA-gels were prepared with bacterial fermentation of hyaluronic acid（HA）and divinyl sulfone（DVS）．To remove unreacted cross linking agent， many experiments were programmed．The content of DVSin gels was determined by gas chromatography．The HA-gels could be prepared under optimal reaction conditions，which established foundation to develop cosmetic HA products．

crosslinked sodium hyaluronate; divinyl sulphone; gas chromatography

TQ 464.1

A

1671-9905（2011）09-0008-02

王艷果（1981-），女，碩士，研究方向為有機(jī)合成，E-mail:hxswyg＠126．com

2011-05-26