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        節(jié)球藻和柱胞藻毒素免疫分析的前處理方法研究

        2011-12-20 00:56:42殷浩文
        關(guān)鍵詞:檢測

        李 雙, 殷浩文

        (1.華東師范大學 生命科學學院,上海 200062;2.上海市檢測中心,上海 201203)

        節(jié)球藻和柱胞藻毒素免疫分析的前處理方法研究

        李 雙1, 殷浩文2

        (1.華東師范大學 生命科學學院,上海 200062;2.上海市檢測中心,上海 201203)

        采用固相萃取前處理技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assays,ELISAs)檢測技術(shù),研究了水樣中節(jié)球藻和柱胞藻毒素的免疫前處理方法.由于兩種藻毒素極性差異較大,分別對水樣中節(jié)球藻和柱胞藻毒素采用不同的前處理方法,具體如下.①節(jié)球藻毒素:先后用10 mL甲醇和10 mL純水活化C18柱,以3~4 mL/min的速度上樣后用10 mL純水淋洗,再用12 mL甲醇洗脫節(jié)球藻毒素,氮氣吹干后純水定容至1 mL待測.②柱胞藻毒素:先后用10 mL甲醇和10 mL純水活化碳黑固相萃取柱,以2~3 mL/min的速度上樣后用10 mL甲醇淋洗,再用12 mL含0.1%三氟乙酸的甲醇洗脫柱胞藻毒素,氮氣吹干后用0.1%氨水定容至1 mL待測.結(jié)果表明,這兩種前處理方法對節(jié)球藻與柱胞藻毒素的ElISAs檢測能保證有較好的回收率,加標回收率可分別達到99.4%和77%.

        節(jié)球藻毒素; 柱胞藻毒素; ELISAs

        0 引 言

        自1878年George Francis報道第一起澳大利亞有毒藍藻水華事件以來[1],全世界范圍內(nèi)由于加速的水體富營養(yǎng)化(eutrophication)現(xiàn)象而產(chǎn)生的淡水水華越來越多.有毒藻類形成的水華或赤潮越來越頻繁地出現(xiàn)在沿海及內(nèi)陸水域,歐洲、美洲、非洲、大洋洲、中東和亞洲等地區(qū)均出現(xiàn)過藍藻引發(fā)的水華[2],其中有50%~75%的藍藻水華會產(chǎn)生藻毒素[3],并以微囊藻、節(jié)球藻和柱胞藻藻毒素最為常見.它們主要通過飲水或食用被毒素污染的水產(chǎn)品等途徑進入人體,進而影響人類健康[4].目前對微囊藻毒素的研究較為普遍,而同樣廣泛發(fā)生的節(jié)球藻和柱胞藻毒素由于技術(shù)的原因(微量、干擾嚴重及前處理復雜等)研究較少.節(jié)球藻毒素(Nodularins,NOD)是一種環(huán)狀的五肽肝毒素,主要作用于肝臟,能抑制絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶1和2A的活性,具有強烈的促肝腫瘤的作用[5],它不僅是腫瘤促進劑,也是直接的致癌物質(zhì)[6].柱胞藻毒素(Cylindrospermopsins,CYN)是近年來才發(fā)現(xiàn)的一種生物堿類肝毒素,主要作用于肝臟和腎臟組織,能夠抑制蛋白質(zhì)的合成,以共價修飾改變DNA或RNA引起基因損傷.柱胞藻毒素及其代謝物能夠作用于細胞分裂過程中的紡錘體或著絲粒,導致整個染色體丟失[7].目前對于節(jié)球藻和柱胞藻毒素的分析方法幾乎空白,而節(jié)球藻和柱胞藻毒素在實際飲用水中的污染問題卻日漸嚴重,因此急需一種靈敏、快速、準確的方法對其進行檢測和定量.

        對于藻毒素的前處理研究主要運用于高效液相色譜法等化學檢測中,免疫檢測的樣品都不經(jīng)過前處理,水樣過濾后直接進行免疫檢測.由于水樣的復雜背景會影響免疫檢測的效果,同時考慮到免疫檢測的特殊性,應(yīng)用于化學檢測中的前處理程序也不能直接用于免疫檢測.因此,本文在綜合國內(nèi)外文獻的基礎(chǔ)上,采用比較研究的方法,以SPE技術(shù)和ELISAs為手段,對節(jié)球藻和柱胞藻藻毒素的富集前處理做了重點研究.在雜質(zhì)淋洗和目標化合物洗脫等關(guān)鍵過程優(yōu)化的基礎(chǔ)上,建立了這兩種藻毒素的前處理方法,以保證水體中痕量毒素檢測的快速性和準確性.

        1 材料與方法

        1.1 儀器和材料

        C18反相固相萃取柱(Waters,美國);碳黑固相萃取小柱(CNW,德國);0.22μm水相濾膜(MILLI-PORE,美國);酶標儀(BioTek,美國);超純水系統(tǒng) (Milli-Q,美國);甲醇(SIGMA,美國);甲酸、三氟乙酸(ACROS,美國);節(jié)球藻毒素/柱胞藻毒素檢測試劑盒(Beacon美國).

        1.2 節(jié)球藻和柱孢藻毒素的檢測步驟

        按照試劑盒說明書操作進行.

        1.3 實驗方法

        藻毒素的固相萃取前處理流程為:活化柱子→上樣→淋洗→洗脫→吹干定容→Elisa檢測.

        本次實驗對該流程中節(jié)球藻毒素的淋洗,柱胞藻毒素的柱子活化及洗脫給予了重點優(yōu)化,具體步驟如下.

        1.3.1 節(jié)球藻毒素淋洗方式優(yōu)化

        100 mL純水中加入1 mL1μg/L的NOD標樣,混勻后通過預先經(jīng)10 mL純甲醇和10 mL純水活化的C18固相萃取柱,流速3~4 mL/min,然后分別用10 mL純水、10%甲醇和20%的甲醇淋洗,每組做3個平行加標和1個空白對照,12 mL純甲醇洗脫,收集于底部有刻度的梨形燒瓶中,洗脫液在35℃下用氮吹儀吹干,氮吹過程中用少量純甲醇淋洗瓶壁,吹干后用純水定容至1 mL,并利用水相針式過濾器(0.22μm)過濾到樣品瓶中,根據(jù)1.2步驟檢測,對比純水、10%甲醇和20%甲醇三者的淋洗效果.

        1.3.2 節(jié)球藻毒素湖水加標實驗

        取0.22μm水相濾膜過濾后的淀山湖水100 mL,加入1 mL1μg/L的NOD標樣,混勻,上樣后用10 mL純水淋洗,其它步驟同1.3.1.做3個平行加標和1個空白對照.

        1.3.3 柱胞藻毒素固相萃取柱活化方式

        碳黑固相萃取小柱的活化有兩種方式:A組用10 mL純甲醇和10 mL純水活化,B組用10 mL甲醇和10 mL0.1%甲酸水溶液活化,兩組分別做3個平行加標和1個空白對照.100 mL純水中加入1 mL1μg/L的CYN標樣混勻,然后以2~3 mL/min的速度通過活化的碳黑固相萃取柱,用12 mL含0.1%三氟乙酸的甲醇洗脫,收集于底部有刻度的梨形燒瓶中,洗脫液于35℃下用氮吹儀吹干,氮吹過程中用少量純甲醇淋洗瓶壁,吹干后用0.1%氨水定容至1 mL,并利用水相針式過濾器(0.22μm)過濾到樣品瓶中,根據(jù)1.2步驟檢測得出結(jié)果,對比兩種活化方式的效果.

        1.3.4 柱胞藻毒素洗脫溶劑優(yōu)化

        選擇10 mL純甲醇和10 mL純水活化碳黑固相萃取小柱,采用純水加標的方式,選擇含1%甲酸的50%甲醇和含0.1%三氟乙酸的甲醇作為洗脫溶劑,其他步驟同1.3.3,對比兩種洗脫溶劑的效果,每組分別做3個平行加標和1個空白對照.

        1.3.5 柱胞藻毒素湖水加標實驗

        但是,在RTK技術(shù)的實際應(yīng)用過程中,如果系統(tǒng)誤差得不到完全的消除,就會影響工程數(shù)據(jù)的真實性、客觀性和準確性。參考站作為一個工作站,其校正數(shù)據(jù)的有效作用距離就是RTK技術(shù)在實際應(yīng)用中的最大問題。同時,GPS技術(shù)在使用過程中,受到空間相關(guān)性的影響,其誤差也隨參考站與移動站的實際距離的改變而發(fā)生非線性變化,進而導致定位精度降低。因此,在實際應(yīng)用過程中,必須采取一定的措施降低測量過程中的系統(tǒng)性誤差。

        取0.22μm水相濾膜過濾后的淀山湖水100 mL,加入1 mL2μg/L的CYN標樣,混勻,用10 mL純甲醇和10 mL純水活化碳黑固相萃取小柱,用含0.1%三氟乙酸的甲醇為洗脫溶劑,其他步驟同1.3.3.做3個平行加標和1個空白對照.

        2 實驗結(jié)果

        2.1 節(jié)球藻毒素優(yōu)化實驗結(jié)果

        2.1.1 節(jié)球藻毒素淋洗方式優(yōu)化

        純水、10%甲醇和20%甲醇三者的淋洗效果如表1.結(jié)果顯示,淋洗中隨著甲醇濃度的增加,回收率逐漸降低,即淋洗損失的毒素也越來越多,而純水淋洗則能夠保證回收率在80.6%.因此,節(jié)球藻毒素的淋洗中,本實驗選擇純水作為淋洗溶劑,以減少在這一過程中毒素的損失,保證回收率.

        表1 淋洗方式優(yōu)化Tab.1 Optimization of purge solvent

        2.2 節(jié)球藻毒素湖水加標實驗

        淋洗方式的優(yōu)化結(jié)果顯示純水的淋洗效果較好,為了驗證在實際水樣中整個固相萃取流程的效果,做了湖水加標實驗.結(jié)果如表2所示.選擇純水淋洗、甲醇洗脫的整個固相萃取流程回收率為83%~106.7%,平均回收率為94.3%,表明該固相萃取流程能夠作為實際水體中節(jié)球藻毒素免疫檢測的前處理方法.?

        表2 NOD湖水加標結(jié)果Tab.2 Recoveries of NOD added in lake water

        2.3 節(jié)球藻毒素優(yōu)化后方法

        優(yōu)化后的節(jié)球藻毒素前處理方法如下:分別用10 mL甲醇和10 mL純水活化柱子,以流速3~4 mL/min上樣,然后用10 mL純水淋洗,12 mL甲醇洗脫,洗脫液于35℃下用氮氣吹干,純水定容至1 mL,4℃保存待測.整個流程如下,其中重點優(yōu)化步驟為淋洗方式.

        2.4 柱胞藻毒素固相萃取柱活化方式

        純水活化與0.1%甲酸水活化的效果對比如表3.結(jié)果顯示,兩者都能保證實驗的回收率,但是純水活化的效果更好,而且取材方便.因此柱胞藻毒素固相萃取柱的活化就選擇純水,即選擇10 mL純甲醇和10 mL純水活化碳黑固相萃取小柱.

        表3 固相萃取柱活化方式Tab.3 Optimization of activation

        2.5 柱胞藻毒素洗脫溶劑優(yōu)化

        用含1%甲酸的50%甲醇和含0.1%三氟乙酸的甲醇作為洗脫溶劑,對比兩種溶劑的洗脫效果,結(jié)果如表4所示.兩者都能充分洗脫柱胞藻毒素,回收率分別是100.4%和118.7%,由于后者在氮吹過程中比前者速度快,因此,洗脫溶劑就選擇0.1%三氟乙酸的甲醇,既能較快完成氮吹過程,又能充分洗脫毒素,提高效率.

        表4 洗脫溶劑優(yōu)化結(jié)果Tab.4 Optimisation of eluent

        表5 CYN湖水加標結(jié)果Tab.5 Recoveries of CYN added in lake water

        2.7 柱胞藻毒素優(yōu)化后方法

        柱胞藻毒素的前處理優(yōu)化方法中對柱子的活化方式和毒素的洗脫溶劑進行了重點優(yōu)化優(yōu),具體步驟為:10 mL甲醇和10 mL純水活化碳黑固相萃取小柱,以2~3 mL/min的速度上樣,然后用10 mL甲醇淋洗,用12 mL含0.1%三氟乙酸的甲醇洗脫毒素,洗脫液在35℃條件下氮氣吹干,用0.1%氨水定容至1 mL,4℃保存待測.整個流程為:活化柱子→上樣→10 mL甲醇淋洗→0.1%三氟乙酸甲醇洗脫→吹干0.1%氨水定容→Elisa檢測.

        3 討 論

        ELISAs是應(yīng)用最為廣泛的一種免疫檢測方法,其基本原理是把抗原抗體反應(yīng)的特異性和敏感性與酶的高效催化作用相結(jié)合.它在實際檢測中具有一系列的優(yōu)勢,如靈敏度高、檢測速度快等,自1990年ELISAs就開始用于藻毒素的檢測[8].但在實際水樣的檢測中,由于毒素含量低,水樣背景復雜,干擾因素多,在分析前一般需要對樣品進行預富集.目前用固相萃取柱(Solid Phase Extraction,SPE)對藻毒素水樣進行富集的方法已有很多研究.

        在節(jié)球藻毒素的固相萃取中,洗脫液一般用純甲醇[9-11],也有少數(shù)采用含有0.1%三氟乙酸的甲醇[12].在本實驗的ELISAs檢測中,HRP標記的毒素與樣品中的毒素競爭結(jié)合數(shù)量有限的抗體位點.研究顯示[13],極少量的三氟乙酸也能強烈抑辣根過氧化物酶(HRP)的活性,甲醇對HRP也有著明顯的抑制作用,從而造成假陽性結(jié)果.因此本文選取純甲醇作為洗脫溶劑,氮氣吹干后純水定容,避免了有機溶劑對ELISAs反應(yīng)中HRP活性的干擾.湖水加標結(jié)果顯示,該方法回收率為83%~106.7%,平均為94.3%,能夠滿足環(huán)境樣品免疫檢測的前處理需要.

        對于柱胞藻毒素的固相萃取前處理,由于它的極性很強,在各種固相萃取柱上的保留效果都不是很好,有關(guān)環(huán)境水樣中柱胞藻毒素的富集方法研究尚少.一般是將毒素從藻細胞或水樣中萃取出來后直接進行HPLC-PDA或HPLC-MS/MS分析.Sachiko[14]利用陰離子交換原理在Oasis MAX柱上富集環(huán)境水樣中的柱胞藻毒素,Metcalf[15]用C18柱和碳黑小柱串聯(lián)富集水樣中的柱胞藻毒素,把C18柱接在碳黑小柱前以除去水樣中非極性或弱極性干擾物,得到了滿意的富集效果.目前,國內(nèi)關(guān)于柱胞藻毒素的富集分析方法很少.參考文獻發(fā)現(xiàn),根據(jù)所選柱子的不同,一般有兩種不同的富集方法:甲醇—純水作活化液,1%甲酸的50%甲醇作洗脫液[16],或者是甲醇—含0.1%甲酸的純水作活化液,0.1%三氟乙酸的甲醇作洗脫液[17].本實驗通過純水加標的方式對這兩種活化方式和洗脫溶劑進行了優(yōu)化.如前文所述,ELISAs檢測中HRP標記的柱胞藻毒素與水樣中的毒素競爭結(jié)合有限的抗體,而HRP活性很容易被酸抑制,因此需要考慮氮氣吹干后洗脫液中殘留的酸對HRP的影響.故在洗脫液吹干定容時用0.1%氨水定容,以避免殘留液中的酸抑制HRP活性造成假陽性的結(jié)果.湖水加標結(jié)果顯示,該方法回收率為76%~78%,平均為77%,能夠滿足環(huán)境樣品免疫檢測的前處理需要.

        4 結(jié) 論

        WTO及我國的飲用水標準規(guī)定,水體中微囊藻毒素-LR含量不能高于1μg/L.對于節(jié)球藻和柱孢藻毒素,由于發(fā)現(xiàn)較晚且研究資料有限,目前還沒有國家和組織對其進行含量限制.因此,本文的前處理方法可為相關(guān)標準的建立提供基礎(chǔ)依據(jù).

        本文的節(jié)球藻和柱胞藻毒素的免疫前處理過程如下:①節(jié)球藻毒素 分別用10 mL甲醇和10 mL純水活化柱子,3~4 mL/min的速度上樣后10 mL純水淋洗,12 mL甲醇洗脫,洗脫液在35℃條件下氮氣吹干后用純水定容至1 mL,4℃保存待測.②柱胞藻毒素 分別用10 mL甲醇和10 mL純水活化碳黑固相萃取小柱,2~3 mL/min的速度上樣后10 mL甲醇淋洗,12 mL含0.1%三氟乙酸的甲醇洗脫,洗脫液在35℃條件下氮吹儀吹干后用0.1%氨水定容至1 mL,4℃保存待測.這兩種前處理方法對節(jié)球藻和柱胞藻毒素的ELISAs檢測能保證有較好的回收率,加標回收率可達到94.3%和77%,能夠滿足環(huán)境樣品免疫檢測的前處理需要,可用于環(huán)境水樣的監(jiān)測,確保廣大居民的飲用水安全.同時本方法的研究結(jié)果也能為建立節(jié)球藻和柱胞藻毒素的ELISA檢測標準提供依據(jù).

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        Ex-treatment of immunoassay method for nodularin and cylindrospermopsins

        LI Shuang1, YIN Hao-wen2

        (1.School of Life Science,East China Normal University,Shanghai 200062,China;2.The Bioassay and Safety Assessment,Shanghai Academy of Public Measurement,Shanghai 201203,China)

        Effective solid phase extraction (SPE)ex-treatment method and sensitive enzymelinked immunosorbent asssay(ELISA)were developed for determining the nodularins(NOD)and cylindrospermopsins(CYN)in water samples.Due to the different polarities,two different ex-treatment methods were applied to NOD and CYN,respectively.The methods were developed as followed:①For NOD,firstly the C18column was activated by 10 mL methanol and 10 mL Milli-Q water;then the sample was applied to the column at 3-4 mL/min;after washing the column with10 mL water,the NOD was eluted with10 mL methanol;then the eluent was driedup with a rotary evaporator,and lastly the final volume was fixed to 1 mL with Milli-Q water for ELISA analyse.②For CYN,the carb SPE tubes were activated with10mL methanol and 10mL Milli-Q water;then the sample was applied to the tubes at 2-3 mL/min;after washing the tubes with 10mL methanol,the CYN was eluted with12 mL methanol containing 0.1%trifluoroacetic acid;then the eluent was dried up with a rotary evaporator,lastly the final volume was fixed to 1 mL with Milli-Q water containing 0.1%ammonia for ELISA analyse.The results indicated that these methods can guarantee the good recoveries of NOD and CYN for ELISA analyse,which could reach to 94.3%and 77%,respectively.

        nodularins; cylindrospermopsins; ELISAs

        Q89

        A

        10.3969/j.issn.1000-5641.2011.06.013

        1000-5641(2011)06-0108-07

        2010-11

        上海市自然科學基金(08ZR1416600)

        李雙,女,碩士研究生.E-mail:lis2011@126.com.

        殷浩文,男,教授級高級工程師,研究方向為環(huán)境毒理學.E-mail:yinhaowen@126.com.

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