劉家舉 張志強

禁食對東方蠑螈胃腸道5-羥色胺細胞形態(tài)和分布型的影響

劉家舉 張志強＊

(安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院,合肥230036)

目的 禁食對東方嶸螈(Cynops orientalis)胃腸道5-羥色胺細胞形態(tài)學特點和分布密度的影響。方法 SP(streptavidin peroxidase)免疫組織化學方法。結(jié)果 喂食組東方蠑螈胃腸道5-羥色胺開放型和閉合型細胞的比值高峰為幽門和十二指腸,直腸其次,其余部位較為接近;禁食組幽門最高,十二指腸其次,賁門、空腸、回腸和直腸最低。禁食組胃體和空腸的比值高于喂食組,回腸低于喂食組,其余部位無組間差異。喂食組幽門和直腸的分布密度最高,胃體最低;禁食后,十二指腸的分布密度最高,賁門和回腸最低。禁食組胃體的分布密度顯著高于喂食組,其余部位無組間差異。結(jié)論 東方蠑螈可通過胃體、空腸和回腸開放型5-羥色胺細胞數(shù)量的調(diào)整及胃體分布密度的增加來調(diào)節(jié)禁食后胃腸道的消化和吸收能力。

禁食; 東方蠑螈; 胃腸道; 5-羥色胺細胞; 分布密度

5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)免疫活性細胞屬內(nèi)分泌細胞類,對消化功能具有很強的調(diào)節(jié)作用[1]。目前,通過使用哺乳類5-HT抗血清,已對多個類群的脊椎動物做過定位和鑒別研究[1-3],關(guān)于兩棲類已有較多報道,但多集中于無尾類動物[4-19],除對無斑肥螈(Pachytriton labiatum)[20]的消化道、黑斑蠑螈(Triturus vulgaris)和冠北螈(Triturus cristatus)[21]的腸道進行過定位研究外,在有尾類中尚無其他報道。這些研究表明,兩棲類消化道5-HT細胞可分為閉合型和開放型兩種類型[3-1],兩種細胞的比值從十二指腸至直腸呈逐漸降低的趨勢[21],多數(shù)種類在胃幽門部密度最高,食道和/或直腸處密度最低[3–10,20],但分布型也有明顯的種間差異[11-17],這可能與動物的食性或消化生理狀態(tài)有關(guān)。處于饑餓狀態(tài)的太行隆肛蛙(Paa taihangnicus)[8],其胃腸道5-HT細胞的分布密度具有胃幽門部和小腸兩個峰值,但飽食狀態(tài)只在胃幽門部有一個峰值;禁食15天后,黑斑蛙(Pelophylax nigromaculata)的食道、胃賁門部和胃體5-HT細胞的密度低于喂食組,但其余部位無組間差異[6]。東方嶸螈(Cynops orientalis)隸屬于兩棲綱有尾目,禁食狀態(tài)下,它通過調(diào)整胃腸道前后端內(nèi)分泌細胞的總數(shù)來適應(yīng)短時間的饑餓狀態(tài)[22],本文進一步采用免疫組織化學方法,比較了正常取食和禁食狀態(tài)下胃腸道主要的內(nèi)分泌細胞類型—5-HT細胞的形態(tài)學特點和分布密度的變化,擬從組織學和細胞化學的角度闡明禁食對其胃腸道消化和吸收能力的影響。

材料和方法

1.材料

2010年3月于合肥市裕豐花市購買東方蠑螈12只,暫養(yǎng)于60 cm ×30 cm ×40 cm的水族箱內(nèi)。用報紙遮住水族箱四周,自然光照,以孑孓為食,每隔3天換水一次,保持水質(zhì)清澈。一個月后,隨機取出6只動物,稱量體重和體長后,用雙毀髓法處死動物,迅速取出胃腸道,用0.1 mol/l PBS清洗后,按胃賁門部、胃體、胃幽門部、十二指腸、空腸、回腸和直腸取材,每段截取0.5-1 cm長的組織塊。用無冰醋酸的Bouin’S液固定組織塊18-24 h,常規(guī)脫水透明,石蠟包埋,切片(6μm)。剩余的6只動物做禁食處理,共處理15天,胃腸道的取材和切片方法同喂食組。

2.主要試劑

即用型(ready to use)5-HT抗血清(兔抗人)和鏈霉菌抗生物素蛋白一過氧化物酶免疫組織化學試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,由美國ZYMED公司生產(chǎn),產(chǎn)品代號為ZA-0231。

3.免疫組織化學方法

常規(guī)石蠟切片脫蠟至水。用0.3%H2O2甲醇溶液孵育15 min,0.01mol/L PBS沖洗3次 ×5 min,滴加正常山羊血清,37℃孵育15 min,吸去多余血清,滴加一抗,4℃過夜。PBS洗滌 3次 ×5 min,滴加即用型生物素標記的二抗 (羊抗兔Ig G抗血清),37℃孵育15 min。PBS洗滌3次×5 min,滴加即用型鏈霉菌抗生物素蛋白—過氧化物酶,37℃孵育20 min。PBS浸洗3次×5 min,DAB-H2O2顯色,蒸餾水沖洗,脫水,透明,封片。陰性對照,分別以正常羊血清和PBS代替一抗,其余步驟同上。

4.觀察與細胞計數(shù)

在Motic-BA 210型顯微鏡下觀察,拍照,計數(shù)。對每只東方蠑螈胃腸道的每個取材部位,取相距至少5張且組織結(jié)構(gòu)完整的切片5張,每張切片隨機取10個400倍視野計數(shù),取10個視野的平均值表示每張切片上5-HT細胞的數(shù)量,再以5張切片的平均值表示該只動物該部位的數(shù)量,最后以6只動物各部位的平均值表示喂食組或禁食組胃腸道每一部位5-HT細胞的總數(shù)量、開放型細胞的數(shù)量和閉合型細胞的數(shù)量

5.統(tǒng)計學分析

用SPSS 11.5 for windows進行數(shù)據(jù)處理。經(jīng)Kolmogorov-Simirnov test檢驗,所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布。用獨立樣本 t-檢驗(independent-samples t-test)比較喂食組與禁食組動物的體重和體長,以及胃腸道各部位開放型與閉合型細胞的比值及5-HT細胞密度的組間差異。以單因素方差分析(one-way ANOVA)及多重比較(multiple comparisons)post hoc test統(tǒng)計喂食組和禁食組組內(nèi)胃腸道各部位開放型和閉合型細胞的比值及5-HT細胞的分布密度的差異。文中數(shù)據(jù)均以平均值 ±標準誤(mean±SE)表示,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

結(jié) 果

禁食組東方蠑螈的平均體重為1.47±0.12 g,顯著低于喂食組(2.64±0.26 g)(t=4.04,P<0.01),但體長無組間差異(喂食組:71.79±2.41 mm,禁食組:64.56±2.29 mm;t=2.17,P>0.05)。

1.禁食對5-HT細胞形態(tài)學特點的影響

喂食組東方蠑螈胃腸道開放型和閉合型細胞的比值高峰為幽門和十二指腸,直腸其次,胃體和空腸最低(F6,35=9.700,P<0.05);禁食組幽門最高,十二指腸其次,賁門、空腸、回腸和直腸最低(F6,35=8.483,P<0.05)。禁食組胃體和空腸的比值高于喂食組,回腸低于喂食組,其余部位無組間差異。(表1)

喂食組賁門的5-HT細胞主要分布于腺泡上皮、腺泡細胞或胃上皮細胞之間,細胞呈圓形或橢圓形(圖1);胃體和幽門的5-HT細胞主要分布于腺泡上皮之間或上皮基部,少數(shù)細胞呈錐形或梭形(圖2、3);十二指腸的5-HT細胞位于上皮基部,細胞呈圓形(圖4)或錐體形;空腸的5-HT細胞位于上皮基部或上皮細胞之間,細胞呈橢圓形或圓形(圖5);回腸和直腸的5-HT細胞位于上皮基部,細胞呈錐形、梭形或圓形(圖 6、7)。

禁食組賁門和幽門5-HT細胞的分布位置和形態(tài)學特征與喂食組相似,胃體多數(shù)細胞為錐體形(圖8-10)。十二指腸的5-HT細胞主要分布于上皮細胞之間,細胞呈錐形、長楔形(圖 11、12)或圓形;空腸的5-HT細胞主要分布于分布于上皮基部或上皮細胞之間,細胞呈棒狀或楔形(圖13);回腸和直腸的5-HT細胞主要分布于上皮基部,細胞呈圓形或錐形(圖 14、15)。

表1 東方蠑螈喂食組與禁食組胃腸道各部位開放型與閉合型5-羥色胺細胞的比值Table 1 Ratio between open and closed populations of 5-hydroxytryptamine-producing cells along the different regions of gastrointestine of Cynop s orientalis in both feeding and fasting group s

2.禁食對5-HT細胞分布密度的影響

喂食組5-HT細胞在幽門和直腸處分布密度最高,賁門、十二指腸、空腸和回腸居中,胃體最低(F6,35=4.095,P<0.05);禁食后,5-HT細胞在十二指腸處分布密度最高,胃體、幽門和空腸居中,賁門和回腸最低(F6,35=3.983,P<0.05)。禁食組胃體的分布密度顯著高于喂食組,其余部位無差異。(表2)

表2 喂食組與禁食組東方蠑螈胃腸道5-羥色胺細胞的分布密度Table 2 The distributive density of 5-hydroxytryptamine cells along the gastrointestine of Cynops orientalis in both feeding and fasting groups

討 論

東方蠑螈禁食組回腸開放型和閉合型5-HT細胞的比值低于喂食組,胃體和空腸高于喂食組;胃體5-HT細胞的分布密度高于喂食組。這說明,禁食可影響東方蠑螈胃腸道5-HT細胞的形態(tài)學特征和分布型,東方蠑螈可通過調(diào)整5-HT細胞形態(tài)的改變和分泌強度的變化來調(diào)節(jié)胃腸道的消化和吸收能力。

喂食組東方蠑螈5-HT細胞在幽門和直腸分布密度最高,胃體最低。多數(shù)兩棲動物消化道5-HT細胞集中分布于幽門,在食道和/或直腸處最低[2-9],也有一些種類分布密度高峰位于胃賁門部[11,12]、胃體[13]、十二指腸[14]、空腸[15,16]或回腸[6]。東方嶸螈喂食組5-HT細胞的分布型不同于已研究過的無尾類動物[2-18],與有尾類動物也有差異[19-20]。無斑肥螈在幽門的密度最高,食道、賁門和直腸最低[19],黑斑蠑螈和冠北螈的腸道均在十二指腸和直腸具有較高的分布密度,空腸和回腸較低[20]。東方嶸螈喜食孑孓、水蚯蚓、面包蟲等昆蟲,生活在山間或山麓的靜水處,平時在水底或水草下面,一般隔幾分鐘需游至水面進行呼吸;無斑肥螈體形較大,主要捕食石蠅、螺類、蝦、蟹等小動物,以水棲生活為主,白天多棲于石下,夜晚多在水底石上爬行。兩者的生活環(huán)境相似,食性可能是影響5-HT細胞分布型不同的主要原因。

禁食使東方蠑螈5-HT細胞的形態(tài)和分布型發(fā)生了改變。5-HT主要由腸粘膜層的嗜鉻細胞分泌產(chǎn)生,物理刺激和化學信號均能促進其分泌[1]。喂食組東方蠑螈開放型和閉合型細胞的比值高峰為幽門和十二指腸,胃體和空腸最低。這與胃部有大量完整的未被消化的食物有關(guān),機械刺激雖能促進5-HT細胞的分泌,但東方蠑螈可能尚未啟動消化程序;在解剖東方蠑螈的胃腸道時,其空腸段未見食物,開放型細胞的數(shù)量下降與5-HT細胞對胃腸道的調(diào)節(jié)功能是相一致的。禁食后,開放型和閉合型細胞的比值在幽門最高,十二指腸和胃體其次,賁門等部位最低,這與饑餓狀態(tài)下,食物的機械刺激減弱或消失,腸道對食靡的消化吸收能力增強有關(guān)。禁食組胃體和空腸的比值高于喂食組,回腸的比值低于喂食組,說明胃體、空腸和回腸能維持較高水平的功能狀態(tài),保持對饑餓的適應(yīng)和調(diào)整能力。一旦解除饑餓狀態(tài),東方蠑螈可能通過調(diào)整5-HT細胞的形態(tài)學特征來調(diào)節(jié)胃腸道的運動和促進消化吸收過程。東方蠑螈禁食后5-HT細胞的分布型與太行隆肛蛙相似[7],但后者只在胃幽門部和十二指腸處密度略有下降,其余部位呈上升趨勢[7]。無論飽食或饑餓狀態(tài),黑斑蛙5-HT細胞的分布型均未發(fā)生顯著改變,但禁食組賁門和胃體的密度都低于喂食組[5]。這說明,兩棲動物對饑餓的反應(yīng)可能具有物種特異性,胃腸道作為彈性器官,可通過5-HT細胞分布型的改變來適應(yīng)食物短缺的環(huán)境。

總之,禁食處理可影響東方蠑螈胃腸道5-HT細胞的形態(tài)學特征和分布型。饑餓時,東方蠑螈可通過增加胃體和空腸開放型5-HT細胞的數(shù)量、減少回腸開放型5-HT細胞的數(shù)量及增加胃體分布密度的方式來調(diào)節(jié)禁食后胃腸道的消化和吸收能力,這種改變可能受禁食時間長短的影響。

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圖 版 說 明

圖1 喂食組胃賁門部橢圓形的5-HT細胞。S-P法,×400

圖2 喂食組胃體錐形的5-HT細胞。S-P法,×400

圖3 喂食組胃幽門部錐形的5-HT細胞。S-P法,×400

圖4 喂食組十二指腸圓形的5-HT細胞。S-P法,×400

圖5 喂食組空腸橢圓形的5-HT細胞。S-P法,×400

圖6 喂食組回腸梭形的5-HT細胞。S-P法,×400

圖7 喂食組直腸圓形和長梭形的5-HT細胞。S-P法,×400

圖8 禁食組胃賁門部橢圓形的5-HT細胞。S-P法,×400

圖9 禁食組胃體錐形的5-HT細胞。S-P法,×400

圖10 禁食組胃幽門部橢圓形和梭形的5-HT細胞。S-P法 ,×400

圖11 禁食組十二指腸錐形的5-HT細胞。S-P法,×400

圖12 禁食組十二指腸長梭形的5-HT細胞。S-P法,×400

圖13 禁食組空腸棒狀和圓形的5-HT細胞。S-P法,×400

圖14 禁食組回腸圓形的5-HT細胞。S-P法,×400

圖15 禁食組直腸圓形和錐體形的5-HT細胞。S-P法,×400

EXPLANATIONOF FIGURES

Fig.1 Ellipse shaped 5-HT cells in the caidia of feeding

group.S-P method,×400

Fig.2 Cone shaped 5-HT cells in the body of stomach of feeding group.S-P method,×400

Fig.3 Cone shaped 5-HT cells in the pylorus of feeding group.S-P method,×400

Fig.4 Round shaped 5-HT cells in the duodenum of feeding group.S-P method,×400

Fig.5 Ellipse shaped 5-HT immunoreactive cells in the jejunum of feeding group.S-P method,×400

Fig.6 Shuttle shaped 5-HT cells in the ileum of feeding group.S-P method,×400

Fig.7 Round and long shuttle shaped 5-HT cells in the rectum of feeding group.S-P method,×400

Fig.8 Ellipse shaped 5-HT cells in the caidia of fasting group.S-P method,×400

Fig.9 Cone-shaped 5-HT cells in the body of stomach of fasting group.S-P method,×400

Fig.1 0 Ellipse and shuttle shaped 5-HT cells in the pylorus of fasting group.S-P method,×400

Fig.1 1 Cone shaped 5-HT cells in the duodenum of fasting group.S-P method,×400

Fig.1 2 Long wedge shaped 5-HT cells in the duodenum of fasting group.S-P method,×400

Fig.1 3 Bar and round shaped 5-HT cells in the ileum of fasting group.S-P method,×400

Fig.1 4 Ellipse shaped 5-HT cells in the rectum of fasting group.S-P method,×400

Fig.1 4 Round shaped 5-HT cells in the ileum of fasting group.S-P method,×400

Fig.1 5 Round and cone shaped 5-HT cells in the rectum of

fasting group.S-P method,×400

EP:上皮 (epithelium)SG:胃腺 (stomach gland)標尺 (scale)=10μm

Effects of fasting on mor phology and distr ibutive mode of 5-hydroxytryptamine cells along the gastrointestinal tract of cynops or ientalis

Liu Jiaju,Zhang Zhiqiang＊
(School of Animal Science and Technology,Anhui Agricultural University,Hef ei 230036,China)

Objective To study the effects of fasting on the morphological features and distributive density of 5-hydroxytryptamine(5-HT)cells along the gastrointestinal tract of Cynops orientalis.Methods Streptavidin-peroxidase immunohistochemical method was used.Results The ratio between open and closed type 5-HT cells was the highest in pylorus and duodenum,secondary in rectum,and the lowest in other portions with a similar distributive density in the feeding group.In the fasting group,it was the highest in pylorus,secondary in duodenum,and the lowest in cardia,jejunum,ileum and rectum.The ratio was higher in f undus and jejunum in the fasting group than in the feeding group,lower in the ileum,but not different in other portions.5-HT cells in feeding group showed the highest density in pylorus and rectum,and the lowest in the f undus;in the fasting group,the highest density was in the duodenum,and the lowest in cardia and ileum.The distributive density of 5-HT cells in f undus was higher in the fasting group than in the feeding group,but not different in other portions.Conclusion Cynops orientalis may mainly rely on the changed number of open type 5-HT cellsin the regionsof f undus,jejunum and ileum,as well as the increased distributive density in thef undus to regulate the digestive and absorptive capacity during fasting period.

Fasting; Cynops orientalis; Gastrointestine; 5-Hydroxytryptamine cells; Density

R322.44 R322.45

A

10.3870/zgzzhx.2011.03.009

2010-07-20

2010-12-01

安徽農(nóng)業(yè)大學穩(wěn)定人才基金項目(wd-2010-02)

劉家舉,男 (1986年),漢族,碩士研究生。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)