張瑩瑩 曹洪玉,2 唐 乾,2 鄭學(xué)仿,2,*

(1大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,遼寧大連116622;2大連大學(xué),遼寧省生物有機(jī)化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116622)

不同類(lèi)型表面活性劑與高鐵肌紅蛋白相互作用

張瑩瑩1曹洪玉1,2唐 乾1,2鄭學(xué)仿1,2,*

(1大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,遼寧大連116622;2大連大學(xué),遼寧省生物有機(jī)化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116622)

通過(guò)UV-Vis吸收光譜、同步熒光光譜、圓二色(CD)光譜等方法對(duì)陰離子型表面活性劑——琥珀酸二辛酯磺酸鈉(AOT)和十二烷基苯磺酸鈉(SDBS)、陽(yáng)離子型表面活性劑——十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)和十二烷基三甲基溴化銨(DTAB)、兩性離子型表面活性劑——3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)與馬心高鐵肌紅蛋白(metMb)的不同作用機(jī)理進(jìn)行了探討.結(jié)果顯示:陰、陽(yáng)離子型表面活性劑可以與蛋白發(fā)生較強(qiáng)烈的作用,且相互作用與表面活性劑的濃度密切相關(guān).AOT和SDBS濃度的升高使得metMb的Soret帶發(fā)生紅移且出現(xiàn)兩個(gè)新的Q帶,伴隨著配體金屬電荷轉(zhuǎn)移(LMCT)帶的消失,蛋白從水合的六配位高自旋復(fù)合物(6-cHs)轉(zhuǎn)化成六配位低自旋高鐵血紅素復(fù)合物(6-cLs),低濃度的AOT和SDBS對(duì)Tyr和Trp微環(huán)境均有影響,能使metMb的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化;而CTAB和DTAB在低濃度時(shí)對(duì)metMb的血紅素中心影響不大,但是對(duì)Trp和Tyr的微環(huán)境影響很大,高濃度時(shí)主要通過(guò)靜電吸引作用以聚合體形式直接作用于血紅素中心,使Soret帶發(fā)生藍(lán)移,metMb形成五配位高自旋(5-cHs)復(fù)合物,血紅素從疏水腔中釋放出來(lái),metMb的α螺旋含量減少. DTAB由于自身結(jié)構(gòu)的特點(diǎn),與CTAB作用于蛋白的過(guò)程有些區(qū)別,形成了一個(gè)中間態(tài),但最終也導(dǎo)致血紅素的暴露.兩性離子型表面活性劑在測(cè)定濃度范圍內(nèi)不與metMb發(fā)生作用,原因是CHAPS整體呈電中性,其與metMb的陰離子性或者陽(yáng)離子性位點(diǎn)作用的能力很弱,同時(shí)也說(shuō)明metMb表面帶相反電荷的位點(diǎn)相距較遠(yuǎn).結(jié)果充分證明表面活性劑與蛋白相互作用的方式與表面活性劑的種類(lèi)、結(jié)構(gòu)及其濃度有關(guān).

陰離子型表面活性劑;陽(yáng)離子型表面活性劑;兩性表面活性劑;高鐵肌紅蛋白;光譜法

1 引言

表面活性劑與蛋白相互作用廣泛應(yīng)用于食品、化妝品和藥物配方中.1,2人發(fā)和羊毛就是經(jīng)常暴露于表面活性劑中的兩種蛋白質(zhì)底物,表面活性劑能與蛋白分子相互作用并能透過(guò)細(xì)胞膜,沾在皮膚上的表面活性劑有0.5%滲入血液,皮膚上若有傷口則滲透力提高10倍以上,因此表面活性劑可以通過(guò)多種渠道進(jìn)入人體內(nèi),在體內(nèi)積少成多,與其他化學(xué)物質(zhì)結(jié)合,毒性會(huì)增加數(shù)倍,有誘發(fā)癌特性.有些表面活性劑血溶性很強(qiáng),容易引起血紅蛋白的變化,造成貧血癥.肌紅蛋白(Mb)在生物體內(nèi)起著儲(chǔ)存氧和促進(jìn)氧在細(xì)胞中擴(kuò)散的作用,Mb與其他小分子物質(zhì)如細(xì)菌內(nèi)毒素、3海藻糖4和羥基脲5等相互作用結(jié)果表明,一些生物小分子可以使得氧合型肌紅蛋白(oxyMb)轉(zhuǎn)變成高鐵肌紅蛋白(metMb)和hemichrome的形式,而血紅素蛋白的hemichrome形式與一些異常疾病有關(guān),6所以探討表面活性劑對(duì)人體蛋白的影響對(duì)生命過(guò)程中表面活性劑在生物體內(nèi)毒性作用研究具有重要意義.

近年來(lái),關(guān)于蛋白質(zhì)與表面活性劑的作用研究多集中在二者作用時(shí)形成復(fù)合物的結(jié)合方式、表面特性及表面活性劑引起的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化.7-9不同類(lèi)型表面活性劑在不同條件下可形成具有不同結(jié)構(gòu)的分子有序組合體,蛋白質(zhì)是具有二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的兩性聚電解質(zhì),隨著外界條件的變化,分子的荷電性質(zhì)發(fā)生很大變化,因此二者相互作用機(jī)理較為復(fù)雜.Guo等10比較研究了十二烷基硫酸鈉(SDS)和CTAB與血紅蛋白(Hb)相互作用,得出了不同的pH條件下,SDS和CTAB對(duì)Hb的作用強(qiáng)度和作用力不同.在模擬人體弱堿性緩沖環(huán)境體系中全面比較和探討三種不同類(lèi)型表面活性劑與metMb相互作用不同機(jī)理的研究尚無(wú)報(bào)道.為了能更詳細(xì)解釋表面活性劑與蛋白質(zhì)相互作用的本質(zhì),本文選用UV-Vis吸收光譜、同步熒光光譜、CD光譜等技術(shù)分別研究了陰離子型表面活性劑AOT和SDBS、陽(yáng)離子型表面活性劑CTAB和DTAB、兩性離子型表面活性劑CHAPS與metMb相互作用過(guò)程中不同機(jī)理及metMb二級(jí)結(jié)構(gòu)變化,并從分子水平上分析了表面活性劑存在時(shí)metMb的構(gòu)象變化及配位反應(yīng)機(jī)理.

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

馬心肌紅蛋白樣品(美國(guó)Sigma公司),UV-Vis吸收光譜特征峰表明其幾乎全部為metMb,使用時(shí)用Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液(0.05 mol·L-1,pH= 7.4)(PB緩沖液)配制成濃度為8.0×10-6mol·L-1的溶液(避光4°C保存并盡快用于實(shí)驗(yàn));表面活性劑AOT(96%)、DTAB(～99%)、CHAPS(≥98%,TLC)均購(gòu)自Sigma公司,SDBS(AR)購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng),CTAB(AR)購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心,使用前用PB緩沖液配制成各自所需濃度,見(jiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析部分.實(shí)驗(yàn)用水為超純水.儀器主要有日本Jasco公司的V-560型UV-Vis分光光度計(jì)、FP-6500型熒光分光光度計(jì)、J-810型圓二色分光光度計(jì);德國(guó)Julabo公司的F-12型制冷和加熱循環(huán)器.

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 UV-Vis吸收光譜

在比色皿中加入8.0×10-6mol·L-1的metMb溶液2 mL,用微量注射器逐次加入定量的AOT溶液(累積總體積小于50 μL),混勻并避光作用3 min,以緩沖液加入等量的AOT溶液作參比,按照以下條件分別記錄AOT與metMb相互作用的紫外吸收光譜:狹縫寬度為2 nm,掃描波長(zhǎng)范圍220-700 nm,掃描速率400 nm·min-1,響應(yīng)時(shí)間中等.其他四種表面活性劑與metMb作用的紫外吸收光譜檢測(cè)方法同上.

2.2.2 同步熒光光譜

在比色池中加入8.0×10-6mol·L-1的metMb溶液2 mL,用微量注射器逐次加入定量的AOT溶液(累積總體積小于50 μL),混勻,避光作用,控制溫度為(25.00±0.01)°C,靜置3 min后,以Δλ=20 nm和Δλ=60 nm測(cè)定同步熒光光譜的變化情況.激發(fā)和發(fā)射狹縫分別為5 nm,掃描速率為500 nm·min-1,響應(yīng)時(shí)間為0.5 s,檢測(cè)器靈敏度為中等(CTAB和DTAB為低).其他四種表面活性劑與metMb作用的熒光光譜檢測(cè)方法同上.

2.2.3 CD光譜

移取500 μL的8.0×10-6mol·L-1的metMb溶液于0.1 cm石英比色池中,用微量進(jìn)樣器依次加入定量的AOT溶液(累積總體積小于10 μL),進(jìn)行相互作用的圓二色譜測(cè)定.狹縫寬度為1 nm,掃描波長(zhǎng)范圍為190-250 nm,掃描速度為50 nm·min-1,響應(yīng)時(shí)間為2 s,累計(jì)次數(shù)為3次.CD光譜測(cè)定其他四種表面活性劑與metMb作用的方法同上.

3 結(jié)果與討論

3.1 陰離子型表面活性劑

metMb的UV-Vis吸收光譜受血紅素周?chē)奈h(huán)境影響.圖1A和1B分別為用0.034 mol·L-1的AOT、0.01 mol·L-1SDBS滴定濃度為8.0×10-6mol· L-1的metMb緩沖溶液體系測(cè)得的UV-Vis吸收光譜變化曲線(xiàn).結(jié)果顯示AOT和SDBS對(duì)metMb具有相同的影響,下面以AOT為例說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)論.可以看出,在天然狀態(tài)條件下,metMb溶液在409 nm(Soret帶),503 nm(Q帶)和630 nm(LMCT帶)處有特征吸收峰,這是血紅素的中心鐵原子與四個(gè)吡咯環(huán)的氮原子形成配位鍵,第五配位結(jié)合His-93殘基、第六配位結(jié)合一個(gè)水分子形成的6-cHs結(jié)構(gòu)aquometMb的特征譜帶.11隨著AOT濃度的增加,到達(dá)2×10-4mol·L-1后,metMb的Soret帶吸光度值不斷減小;同時(shí),吸收譜帶向長(zhǎng)波長(zhǎng)方向移動(dòng)(409 nm紅移到約414 nm處),且536和566 nm處有新的吸收峰出現(xiàn),并逐漸增強(qiáng),630 nm處的LMCT帶消失.意味著表面活性劑濃度的增加,6-cHS結(jié)構(gòu)的metMb在逐漸消耗.536和566 nm處的新峰與高鐵細(xì)胞色素b5的很相似,12是6-cLS結(jié)構(gòu)的特征峰,此時(shí)蛋白質(zhì)和表面活性劑之間的疏水作用和氫鍵破壞了水分子配體和His-64之間的氫鍵,His-64咪唑環(huán)上的氮原子氫鍵能力的減弱,已配位的水分子不再穩(wěn)定,使得鐵原子第六配位水分子很容易解離出來(lái),取而代之的是His-64.aquometMb逐漸減少,6-cLs結(jié)構(gòu)的hemichrome在不斷生成,即His-64的咪唑環(huán)向金屬中心移動(dòng),形成了雙His配位復(fù)合物.13

圖1 AOT(A)及SDBS(B)對(duì)metMb溶液UV-Vis吸收光譜的影響Fig.1 Effects ofAOT(A)and SDBS(B)on UV-Vis absorbance spectra of metMb solutionCmetMb＝8.0×10-6mol·L-1;(A)104CAOT/(mol·L-1):(a)0,(b)2.0,(c)2.4,(d)3.0,(e)3.4,(f)4.0; (B)104CSDBS/(mol·L-1):(a)0,(b)0.5,(c)0.7,(d)1.3,(e)1.5,(f)1.9

本課題組14研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)咪唑與metMb分子進(jìn)行配位反應(yīng)時(shí),由于這些親核性較強(qiáng)的咪唑分子的引入,咪唑分子電荷通過(guò)Fe3+轉(zhuǎn)移到卟啉環(huán)上,使得卟啉環(huán)上電子密度增大,a1u(π)軌道能量增加,與間的能量差減小,激發(fā)能降低,因此His-64咪唑環(huán)與血紅素中心鐵原子的配位可以造成Soret帶的紅移.另外,在譜圖中416 nm產(chǎn)生了一個(gè)等吸光點(diǎn),說(shuō)明此時(shí)體系中metMb和所形成的復(fù)合物具有相同的吸光度值.metMb的等電點(diǎn)(pI)是6.99,PB緩沖液的pH是7.4,所以metMb整體呈現(xiàn)負(fù)電性,其與陰離子表面活性劑之間存在靜電斥力,表面活性劑濃度升高時(shí),疏水作用隨后形成.15AOT/SDBS存在時(shí),占主導(dǎo)作用的靜電力使得血紅素周?chē)h(huán)境變化,破壞組氨酸咪唑環(huán)和水分子之間的氫鍵,從而誘導(dǎo)hemichrome的形成.

對(duì)于Mb的同步熒光光譜,Δλ=60 nm時(shí)主要是Trp殘基的特征發(fā)射峰,Δλ=20 nm時(shí)則主要顯示Tyr殘基的熒光.16圖2A是AOT與metMb作用時(shí)Δλ=60 nm的同步熒光光譜,可以看出,隨著AOT濃度的增加,339 nm處熒光峰和351 nm處的肩峰熒光強(qiáng)度均規(guī)律性地增加,且339 nm處的熒光峰紅移了3 nm.天然狀態(tài)下,metMb血紅素近端存在的Trp-7和Trp-14使得每個(gè)Trp的熒光部分猝滅,Trp到血紅素的有效能量轉(zhuǎn)移也被削弱,故metMb中的Trp在緩沖溶液中熒光強(qiáng)度很低.17AOT濃度逐漸升高時(shí)表面活性劑的疏水鏈滲入到疏水腔,Trp極性不斷增強(qiáng),并逐漸從疏水環(huán)境中暴露出來(lái),heme周?chē)h(huán)境的極性也有一定程度的增加,因此,Trp和血紅素之間的熒光猝滅反應(yīng)被減弱,metMb中的Trp熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng).圖3A顯示的是SDBS對(duì)metMb的Trp熒光強(qiáng)度影響,與AOT影響作用相同.造成圖2A中351 nm處肩峰越來(lái)越明顯的原因是雙His配位體系的形成對(duì)metMb中Trp-7和Trp-14殘基微環(huán)境極性的影響不同.14圖2B和圖3B所示的是Tyr的熒光強(qiáng)度變化,在天然態(tài)時(shí),metMb的Tyr與Trp和血紅素之間能量傳遞,有效地猝滅了Tyr自身的發(fā)射強(qiáng)度,而AOT/SDBS的加入使得Tyr的微環(huán)境發(fā)生變化,與Trp和heme的距離變遠(yuǎn),所以熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng);18metMb發(fā)射峰越來(lái)越不明顯,我們認(rèn)為是蛋白表面Tyr-103的Ph－OH基團(tuán)在陰離子型表面活性劑存在時(shí),變成Ph－O-形式,它在大約307 nm處的峰越來(lái)越尖,重疊峰使得311 nm處的最大發(fā)射峰趨于平緩.圖3B中約286 nm處的發(fā)射峰是SDBS濃度越來(lái)越高造成的(見(jiàn)圖3B插圖),其對(duì)311 nm處的發(fā)射峰也有一定的影響.

圖2 AOT對(duì)metMb溶液同步熒光光譜的影響Fig.2 Effects ofAOT on synchronous fluorescence spectra of metMbCmetMb＝8.0×10-6mol·L-1;104CAOT/(mol·L-1):(a)0,(b)2.4,(c)3.0,(d)3.7,(e)4.4

圖3 SDBS對(duì)metMb溶液同步熒光光譜的影響Fig.3 Effects of SDBS on synchronous fluorescence spectra of metMbCmetMb＝8.0×10-6mol·L-1;104CSDBS/(mol·L-1):(a)0,(b)0.6,(c)1.3,(d)1.5,(e)1.9

3.2 陽(yáng)離子型表面活性劑

圖4A是用5×10-2mol·L-1的CTAB滴定濃度為8×10-6mol·L-1的metMb的UV-Vis吸收光譜.可以看出,在CTAB濃度小于2×10-4mol·L-1時(shí),并沒(méi)有使metMb出現(xiàn)Soret帶的紅移現(xiàn)象,也沒(méi)有出現(xiàn)規(guī)則的Q帶新峰,相反,隨著CTAB濃度的增加,Soret帶沒(méi)有伴隨著吸收強(qiáng)度的降低而發(fā)生移動(dòng),與此同時(shí),630 nm處LMCT帶的吸收峰逐漸被掩蓋.當(dāng)CTAB濃度達(dá)到2.25×10-4mol·L-1后,Soret帶藍(lán)移至約400 nm,濃度繼續(xù)增加,603 nm處heme單體的特征吸收峰出現(xiàn),19意味著Fe-His-93位的鍵斷裂,底物配位由羥基替代,5-cHs的血紅素結(jié)構(gòu)生成,也就是heme從metMb分子中脫離出來(lái).與陰離子型表面活性劑相比,CTAB可以直接作用于metMb的血紅素中心,并不與His-64作用或作用很小,沒(méi)有形成6-cLs的hemichrome結(jié)構(gòu),而是使aquomet Mb中的血紅素脫離出來(lái).

同為陽(yáng)離子型表面活性劑,DTAB與CTAB對(duì)metMb的UV-Vis吸收光譜影響作用具有一些共同特征:隨著DTAB濃度的升高,出現(xiàn)了603 nm處的heme特征峰(見(jiàn)圖4B),與metMb的作用也沒(méi)有使蛋白形成6-cL結(jié)構(gòu).但由于metMb的等電點(diǎn)和卟啉環(huán)結(jié)構(gòu),以及DTAB自身結(jié)構(gòu)特點(diǎn)等原因,反映其有自己的光譜特征,且DTAB的臨界膠束濃度(cmc)值比CTAB的高,所以作用濃度也較CTAB大(所用DTAB的滴定濃度為1 mol·L-1).DTAB濃度小于5.5×10-4mol·L-1時(shí),促使metMb的Soret帶發(fā)生少許紅移(約1.5 nm),630 nm的LMCT帶被掩蓋,且出現(xiàn)明顯的527和563 nm的小峰,表明此時(shí)形成了一個(gè)中間態(tài),具體是什么結(jié)構(gòu)還有待進(jìn)一步研究.繼續(xù)增大DTAB的濃度,522和563 nm處的峰強(qiáng)度逐漸減小,在603 nm處heme單體特征峰也出現(xiàn),表明heme從疏水腔解離出來(lái).對(duì)于陽(yáng)離子表面活性劑而言,濃度低于其臨界膠束濃度時(shí),其單體形式的分子對(duì)吸收光譜沒(méi)有影響,濃度高時(shí)形成聚合體或膠束才能與蛋白發(fā)生作用.20另外,在實(shí)驗(yàn)所用的緩沖體系中,metMb卟啉環(huán)外露的羧酸根電離,蛋白整體呈負(fù)電性,其與陽(yáng)離子型表面活性劑之間存在強(qiáng)烈的靜電吸引作用,再加上隨后的疏水作用,15所以DTAB和CTAB對(duì)metMb的作用比AOT和SDBS強(qiáng),可以使metMb中心的heme從疏水腔中解離出來(lái).

圖4 CTAB(A)及DTAB(B)對(duì)metMb溶液UV-Vis吸收光譜的影響Fig.4 Effects of CTAB(A)and DTAB(B)on UV-Vis absorbance spectra of metMbCmetMb＝8.0×10-6mol·L-1;(A)104CCTAB/(mol·L-1):(a)0,(b)1.25,(c)2.00,(d)2.25,(e)2.50,(f)3.00,(g)3.50,(h)10.00,(i)12.00; (B)104CDTAB/(mol·L-1):(a)0,(b)4.0,(c)4.5,(d)5.0,(e)5.5,(f)7.0,(g)10.0,(h)12.0,(i)14.0

圖5A和5B分別是用5×10-2mol·L-1CTAB滴定8.0×10-6mol·L-1的metMb在Δλ=60 nm和Δλ=20 nm時(shí)的同步熒光光譜.由于CTAB對(duì)于metMb的同步熒光光譜影響較強(qiáng),所以檢測(cè)時(shí)用的靈敏度選擇low.當(dāng)CTAB濃度較低(小于1×10-4mol·L-1)時(shí),對(duì)metMb的Tyr和Trp微環(huán)境就能產(chǎn)生較強(qiáng)影響,熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng),且伴隨著最大發(fā)射峰的紅移,Trp的熒光強(qiáng)度變化更強(qiáng)一些.Δλ=60 nm時(shí)也出現(xiàn)351 nm的肩峰,形成的配位體系同樣對(duì)metMb中Trp-7和Trp-14殘基微環(huán)境極性的影響不同.CTAB的濃度逐漸增大,形成越來(lái)越多的膠束,膠束的形成可以降低Trp和血紅素之間的能量傳遞,表面疏水血紅素被溶解在膠束的疏水腔中,使得血紅素和Trp之間的距離越來(lái)越遠(yuǎn),他們之間的能量傳遞也被削弱,根據(jù)F?rster能量轉(zhuǎn)移理論,Trp與血紅素之間的距離增加將使得血紅素的熒光被減弱,metMb的熒光強(qiáng)度增加也變得緩慢.10同理,DTAB也使得metMb中的Trp熒光強(qiáng)度越來(lái)越強(qiáng)(見(jiàn)圖6A),由于DTAB的cmc值較高,所以對(duì)蛋白Trp微環(huán)境影響所需濃度比CTAB要高.圖5B和圖6B顯示Tyr的微環(huán)境也受到影響,最大發(fā)射峰也發(fā)生紅移,極性增強(qiáng);隨著CTAB和DTAB的升高,最大發(fā)射峰仍很明顯,并沒(méi)有變得越來(lái)越平緩,是因?yàn)殛?yáng)離子型表面活性劑存在時(shí),Tyr-103上的Ph－OH并沒(méi)有變成Ph－O-形式.最大發(fā)射峰有少許紅移,說(shuō)明Trp暴露到更強(qiáng)的極性環(huán)境中.與AOT和SDBS相比,CTAB和DTAB對(duì)metMb芳香族氨基酸微環(huán)境的影響更強(qiáng),濃度不斷增高時(shí)可以使血紅素逐漸暴露.

圖5 CTAB對(duì)metMb溶液同步熒光光譜的影響Fig.5 Effects of CTAB on synchronous fluorescence spectra of metMbCmetMb＝8.0×10-6mol·L-1;104CCTAB/(mol·L-1):(a)0,(b)1.0,(c)2.0,(d)5.0,(e)12.0

3.3 兩性離子型表面活性劑

CHAPS是一種兩性離子型表面活性劑,具有陰、陽(yáng)兩種離子性質(zhì),但在中性pH環(huán)境中呈非電離子性質(zhì).圖7A顯示了CHAPS對(duì)metMb UV-Vis吸收光譜的影響,可以看出CHAPS濃度達(dá)到6.1×10-3mol·L-1,檢測(cè)結(jié)果顯示其對(duì)metMb仍沒(méi)有直接的作用,對(duì)Soret帶、Q帶及LMCT帶均沒(méi)有影響,不會(huì)形成hemichrome或者5-cLs的結(jié)構(gòu).此結(jié)果的主要原因是CHAPS在中性條件下成非電離子性質(zhì),整體呈電中性,降低了與蛋白質(zhì)的陰離子性或者陽(yáng)離子性位點(diǎn)作用的能力,同時(shí)也表明在中性pH條件下, metMb的陰離子位點(diǎn)和陽(yáng)離子位點(diǎn)之間的距離相對(duì)較遠(yuǎn).21如果這些位點(diǎn)相對(duì)近一些,CHAPS應(yīng)該比陰離子型或陽(yáng)離子型表面活性劑對(duì)蛋白有更強(qiáng)的作用,因?yàn)槊總€(gè)CHAPS分子都既含有陰離子結(jié)合位點(diǎn)也含有陽(yáng)離子結(jié)合位點(diǎn),可以同時(shí)與蛋白有兩種離子作用.整體呈電中性,CHAPS的這種兩性離子性質(zhì)降低了作為任何一種電荷性質(zhì)與metMb之間的作用.沒(méi)有靜電作用時(shí),表面活性劑與蛋白之間的疏水作用很弱,且難形成.

圖6 DTAB對(duì)metMb溶液同步熒光光譜的影響Fig.6 Effects of DTAB on synchronous fluorescence spectra of metMbCmetMb＝8.0×10-6mol·L-1;(A)103CDTAB/(mol·L-1):(a)0,(b)3.0,(c)4.0,(d)5.0,(e)12.0

圖7 CHAPS對(duì)metMb溶液UV-Vis吸收光譜(A)和同步熒光光譜(B)的影響Fig.7 Effects of CHAPS on UV-Vis absorbance(A)and synchronous fluorescence spectra(B)of metMbCmetMb＝8.0×10-6mol·L-1;103CCHAPS/(mol·L-1):(a)0,(b)0.49,(c)1.5,(d)2.4,(e)4.3,(f)6.1

圖7B為CHAPS對(duì)metMb同步熒光光譜圖,同紫外結(jié)果一致,其濃度達(dá)到6.1×10-3mol·L-1,Δλ=60 nm和Δλ=20 nm(插圖)時(shí),metMb同步熒光光譜均沒(méi)有發(fā)生變化,也就是血紅素周?chē)h(huán)境和芳香族氨基酸Tyr和Trp的微環(huán)境均不受其影響,CHAPS與metMb基本沒(méi)有發(fā)生作用或作用很小.

另外,非離子表面活性劑沒(méi)有離子性質(zhì),也不會(huì)與蛋白質(zhì)發(fā)生靜電作用,與蛋白沒(méi)有直接的相互作用所以也不會(huì)是蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化.22

3.4 各類(lèi)表面活性劑對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)影響

UV-Vis吸收光譜主要集中于研究血紅素口袋周?chē)h(huán)境變化,同步熒光光譜研究的是芳香族氨基酸微環(huán)境的變化,為了更深一步了解表面活性劑與蛋白質(zhì)之間的作用過(guò)程,我們用遠(yuǎn)紫外區(qū)圓二色譜(CD)技術(shù)檢測(cè)了metMb的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化情況，并用楊氏方程算法23計(jì)算Mb中的α螺旋、β折疊等含量變化.圖8A為metMb與AOT反應(yīng)的遠(yuǎn)紫外CD譜圖,在208和222 nm兩個(gè)負(fù)槽,反映的是α螺旋的光譜特性.24可以很明顯地看出,隨著AOT濃度的升高,負(fù)槽的強(qiáng)度逐漸減弱,metMb的α螺旋含量從74%減少到63%,同時(shí),β折疊含量增加了近14%.同紫外-可見(jiàn)圖譜檢測(cè)的結(jié)果相對(duì)應(yīng),AOT改變metMb蛋白的血紅素中心配位的同時(shí)也改變蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu),但形狀和肩峰的位置未發(fā)生明顯改變,整個(gè)蛋白分子結(jié)構(gòu)依然以α螺旋為主,說(shuō)明蛋白在測(cè)定范圍內(nèi)沒(méi)有變性,但是結(jié)構(gòu)有較大變化(大于5%).這主要是由于A(yíng)OT結(jié)合到metMb表面,使蛋白伸展并暴露出疏水殘基,干擾蛋白的螺旋結(jié)構(gòu),更多的β折疊及無(wú)規(guī)則卷曲可溶性暴露結(jié)構(gòu)出現(xiàn),同屬于陰離子型表面活性劑的SDBS對(duì)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)影響規(guī)律也如此(圖未給出).

圖8B是CTAB滴定metMb得到的CD譜圖,結(jié)果顯示CTAB濃度為1×10-4mol·L-1時(shí),metMb的二級(jí)結(jié)構(gòu)已經(jīng)發(fā)生很大變化,比陰離子型表面活性劑對(duì)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)影響更強(qiáng)一些,α螺旋含量減少幅度也較大,繼續(xù)增大CTAB濃度,血紅素從疏水口袋逐漸暴露出來(lái)的同時(shí),蛋白的整個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化,整個(gè)過(guò)程中α螺旋含量減少了近20%,β折疊含量增加了34%,但蛋白骨架結(jié)構(gòu)仍以α螺旋為主.DTAB濃度的升高也會(huì)使得蛋白的α螺旋含量減少,趨勢(shì)與CTAB的相似(圖未給出).

圖8 metMb與AOT(A)、CTAB(B)及CHAPS(C)相互作用的CD譜圖Fig.8 CD spectra of interactions of metMb withAOT(A)、CTAB(B)and CHAPS(C)CmetMb＝8.0×10-6mol·L-1;(A)104CAOT/(mol·L-1):(a)0,(b)1.3,(c)5.4,(d)6.7,(e)8.1,(f)9.4; (B)104CCTAB/(mol·L-1):(a)0,(b)1.0,(c)2.0,(d)4.0,(e)8.0,(f)10.0;(C)103CCHAPS/(mol·L-1):(a)0,(b)0.49,(c)1.5,(d)2.4,(e)4.3,(f)6.1

圖8C顯示在測(cè)定的濃度范圍內(nèi),加入CHAPS前后,此metMb的二級(jí)結(jié)構(gòu)沒(méi)有變化,以α螺旋結(jié)構(gòu)為主,此結(jié)果同紫外、熒光光譜結(jié)果一致,充分說(shuō)明CHAPS沒(méi)有與metMb發(fā)生相互作用,對(duì)蛋白質(zhì)的天然狀態(tài)不產(chǎn)生影響.

4 結(jié)論

當(dāng)溶液的pH值大于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí),蛋白質(zhì)表面呈現(xiàn)負(fù)電性,所以其與不同類(lèi)型的表面活性劑作用所呈現(xiàn)的性質(zhì)不同.本文在模擬人體的弱堿性緩沖體系(pH 7.4)中比較研究了三類(lèi)表面活性劑與metMb相互作用的不同機(jī)理.陰、陽(yáng)離子型表面活性劑通過(guò)靜電作用和疏水作用,主要是靜電作用,與metMb都發(fā)生了直接相互作用,且改變metMb中心卟啉環(huán)的微環(huán)境.陽(yáng)離子型表面活性劑的作用更強(qiáng)一些,這種改變依賴(lài)于表面活性劑的濃度,而兩性離子表面活性劑CHAPS對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基本不產(chǎn)生影響.陰、陽(yáng)離子型表面活性劑也表現(xiàn)出不一樣的特征,AOT和SDBS主要通過(guò)靜電斥力將aquometMb轉(zhuǎn)變成hemichrome結(jié)構(gòu),且對(duì)Trp和Tyr的微環(huán)境均有影響,同時(shí)影響metMb的二級(jí)結(jié)構(gòu),使其α螺旋含量逐漸減少,β折疊含量增加;陽(yáng)離子表面活性劑CTAB和DTAB與metMb的作用更強(qiáng)一些,主要作用力為靜電吸引作用,隨著表面活性劑濃度的升高,并未出現(xiàn)AOT和SDBS與metMb相互作用過(guò)程中產(chǎn)生的6-cLs配位結(jié)構(gòu),而是直接作用于血紅素中心,形成5-cLs結(jié)構(gòu),最終將血紅素暴露出來(lái),且CTAB和DTAB對(duì)metMb的Tyr和Trp微環(huán)境作用強(qiáng)度也比AOT和SDBS強(qiáng),對(duì)metMb的二級(jí)結(jié)構(gòu)也影響也很大.CHAPS在中性pH條件下整體呈電中性,結(jié)果顯示其對(duì)metMb血紅素微環(huán)境、芳香族氨基酸及二級(jí)結(jié)構(gòu)基本沒(méi)有影響,可以保護(hù)蛋白的天然狀態(tài).

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July 29,2011;Revised:October 2,2011;Published on Web:October 13,2011.

Interactions between Different Classes of Surfactants and Metmyoglobin

ZHANG Ying-Ying1CAO Hong-Yu1,2TANG Qian1,2ZHENG Xue-Fang1,2,*
(1School of Life Science and Biotechnology,Dalian University,Dalian 116622,Liaoning Province,P.R.China;2Liaoning Key Laboratory of Bioorganic Chemistry,Dalian University,Dalian 116622,Liaoning Province,P.R.China)

Complexes of horse metmyoglobin(metMb)with the anionic surfactants sodium bis(2-ethylhexyl)sulfosuccinate(AOT)and sodium dodecyl benzene sulfonate(SDBS),the cationic surfactants dodecyl trimethylammonium bromide(CTAB)and dodecyltrimethyl ammonium bromide(DTAB),and the zwitterionic surfactant3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonate (CHAPS)were investigated by UV-Vis absorption,synchronous fluorescence emission,and circular dichroism(CD) spectroscopy.Experimental results show that the anionic and cationic surfactants can interact with metMb intensively depending on the surfactant concentration.The UV-Vis spectra indicate that AOT and SDBS interact with metMb at low concentrations.The addition of AOT(or SDBS)causes the formation of a six-coordinated low-spin heme(6-cLs)hemichrome as is evident from the red shift of the Soret band,the intensity decrease,concomitant appearance of two new Q bands,and the disappearance of ligandto-metal charge transfer(LMCT).The surfactants disturb the Tyr and Trp microenvironment and change the second structure parameter of metMb while the α-helix content decreases.However,the interaction between metMb and CTAB(or DTAB)is different.They cannot disturb heme at very low concentrations but can disturb the Tyr and Trp microenvironment.CTAB and DTAB aggregates can convert metMb to a five-coordinated low-spin heme as shown by the blue shift of the Soret band and cause the heme monomer to leave the hydrophobic cavity of metMb through electrostatic attraction mainly.DTAB/metMb complexes behave in a slightly different way to CTAB/metMb because of their special structure.In contrast,no interaction is evident between the zwitterionic surfactant over a large range of concentrations because of the neutral charge of CHAPS,which precludes an effective electrostatic attraction between the ionic sites of CHAPS and a protein.The significant distance between the ionic sites with opposite charges in metMb precludes a double ionic interaction for each CHAPS surfactant molecule despite the presence of two oppositely charged ionic sites in the CHAPS molecule.Therefore,proteins interact with surfactants in multifarious ways and this depends on the surfactant species,concentration,and structure.

Anionic surfactant;Cationic surfactant;Zwitterionic surfactant;Metmyoglobin; Spectrometry

10.3866/PKU.WHXB20112907

?Corresponding author.Email:dlxfzheng@126.com;Tel:+86-411-87403720.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(20871024),Project for Liaoning Innovation Teams in University, China(2006T002,2008T005,2009T003),Research Foundation of Education Bureau of Liaoning Province,China(2009A069,2009A071),and Project for Dalian Science and Technology,China(2008E11SF170).

國(guó)家自然科學(xué)基金(20871024),遼寧省高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(2006T002,2008T005,2009T003),遼寧省教育廳(2009A069,2009A071)和大連市科技計(jì)劃(2008E11SF170)資助項(xiàng)目

O648;O629.73