張小娟(綜述)，張榮光(審校)

(1.河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，河南洛陽(yáng)471003;2.鄭州大學(xué)河南省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，鄭州450001)

電穿孔轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法是分子生物學(xué)中常用的技術(shù)，廣泛應(yīng)用于基因克隆、外源基因的表達(dá)、基因定位、基因圖譜的繪制等研究［1-3］。雖然基因轉(zhuǎn)移可以通過(guò)化學(xué)的方法實(shí)現(xiàn)，但是操作復(fù)雜且效率低。經(jīng)典的氯化鈣轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化效率較低;病毒轉(zhuǎn)染的方法雖然效率很高，但是對(duì)健康的威脅不可忽視;電穿孔基因轉(zhuǎn)移法適用范圍廣，轉(zhuǎn)化效率高，殘余毒性?。?］，是最有發(fā)展?jié)摿Φ囊环N轉(zhuǎn)化方法。然而，由于影響電穿孔方法的因素較為復(fù)雜，其中一些技術(shù)環(huán)節(jié)的機(jī)制并不十分清楚，轉(zhuǎn)化效果的穩(wěn)定性難以保證，這在一定程度上制約了該方法的推廣應(yīng)用。近年來(lái)，隨著國(guó)內(nèi)外對(duì)該方法應(yīng)用實(shí)踐的增加，人類對(duì)影響電穿孔法轉(zhuǎn)化效率的因素有了更深入的認(rèn)識(shí)?，F(xiàn)對(duì)影響電穿孔法轉(zhuǎn)化效率的因素進(jìn)行綜述。

1 感受態(tài)細(xì)胞

1.1 細(xì)菌濃度 李南等［5］在優(yōu)化大腸埃希菌TG1電轉(zhuǎn)化條件時(shí)，將細(xì)菌懸液按1∶10梯度稀釋，取等體積不同濃度的菌液進(jìn)行電穿孔。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在一定規(guī)范內(nèi)，細(xì)菌濃度越高，轉(zhuǎn)化效率就越高，兩者呈正相關(guān)，菌濃度為1010個(gè)/mL時(shí)，轉(zhuǎn)化效率最高。韋曉明等［6］在探索大腸埃希菌XL1-Blue菌株電轉(zhuǎn)化條件時(shí)，分別用2.5×1013、2.5×1014、2.5×1015個(gè)/L三個(gè)感受態(tài)濃度進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明菌濃度為2.5× 1015個(gè)/L時(shí)的轉(zhuǎn)化效率較菌濃度為2.5×1014個(gè)/L時(shí)高10倍，較2.5×1013個(gè)/L高16倍。

1.2 細(xì)菌生長(zhǎng)周期 細(xì)菌培養(yǎng)到不同密度都能用于電轉(zhuǎn)化，但最好的轉(zhuǎn)化效率是在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。電轉(zhuǎn)化效率和細(xì)胞存活數(shù)均與轉(zhuǎn)化前的細(xì)胞所處生長(zhǎng)階段有關(guān)。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，每個(gè)細(xì)胞對(duì)電擊都非常敏感，死亡率較高。但在存活的細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化子的比例較高(約80%)。

當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)后期，細(xì)胞存活率上升，轉(zhuǎn)化效率也逐漸下降，因此電轉(zhuǎn)化的細(xì)菌以培養(yǎng)到對(duì)數(shù)中期較為合適［7，8］。在制備感受態(tài)時(shí)，常通過(guò)測(cè)定菌液光密度(optical density，OD)值方法判斷細(xì)菌生長(zhǎng)階段。韋曉明等［6］發(fā)現(xiàn)在大腸埃希菌XL1-Blue處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期、OD600為0.3～0.4時(shí)轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最高，隨著細(xì)菌的老化，OD600值每增加0.1，轉(zhuǎn)化效率都會(huì)下降一個(gè)數(shù)量級(jí)以上。所以制備電轉(zhuǎn)化用感受態(tài)時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格掌握菌液的OD值，以保持較高的轉(zhuǎn)化效率。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)溫度 韓峰等［9］采用大腸埃希菌DH5α菌株研究了細(xì)菌培養(yǎng)溫度對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響。研究結(jié)果顯示，在18℃下培養(yǎng)的細(xì)菌，當(dāng)菌液OD600為0.5～1.0時(shí)，轉(zhuǎn)化效率都維持在高水平;而在37℃培養(yǎng)的細(xì)菌，僅當(dāng)OD600為0.6～0.7時(shí)轉(zhuǎn)化效率出現(xiàn)一個(gè)銳利的峰值，菌液OD值偏高或偏低都會(huì)使轉(zhuǎn)化效率顯著下降。

2 電轉(zhuǎn)化過(guò)程

2.1 電場(chǎng)強(qiáng)度 電場(chǎng)強(qiáng)度是影響電轉(zhuǎn)化效率的主要因素。在一定范圍內(nèi)，隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加，外源DNA越容易進(jìn)入細(xì)胞，但細(xì)胞的死亡率也會(huì)隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加而增加。所以要得到最高的電轉(zhuǎn)化效率，一方面要提高電場(chǎng)強(qiáng)度到一個(gè)合適數(shù)值，另一方面又要盡量降低死亡率。戴建新等［10］研究了電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果表明在低電場(chǎng)強(qiáng)度(1～10 kV/cm)作用下，轉(zhuǎn)化效率＜109CFU/μg DNA;而當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度＞10 kV/cm時(shí)，轉(zhuǎn)化效率顯著上升，并在12.5～15 kV/cm時(shí)，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到峰值(約2× 109CFU/μg);當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度繼續(xù)升高時(shí)，轉(zhuǎn)化效率則迅速下降。

2.2 脈沖時(shí)間 研究表明，電脈沖時(shí)間對(duì)電轉(zhuǎn)化效率有較大影響，時(shí)間太短或太長(zhǎng)均會(huì)使轉(zhuǎn)化效率降低。目前，脈沖時(shí)程閾值現(xiàn)象還不能作出理論計(jì)算，但其合理的解釋為:一方面，因?yàn)槟る娙莸某潆娦枰欢ǖ臅r(shí)程，才能使膜電位達(dá)到穩(wěn)定值，這一時(shí)程正好是電穿孔導(dǎo)入小分子的閾值;另一方面，只有外電場(chǎng)持續(xù)提供能量，保持胞膜穿孔部位局部的無(wú)序狀態(tài)，才能使孔道擴(kuò)大至細(xì)胞骨架網(wǎng)孔的大小。如果脈沖時(shí)程過(guò)短，則孔道很快自發(fā)地復(fù)原為有序結(jié)構(gòu)。這可能是采用電穿孔方法導(dǎo)入大分子DNA時(shí)，脈沖時(shí)程存在閾值的原因。戴建新等［10］在探索大腸埃希菌DH5α電轉(zhuǎn)化影響因素時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度為15 kV/cm時(shí)，脈沖持續(xù)時(shí)間取4～5 ms，其轉(zhuǎn)化效率即達(dá)峰值;若脈沖持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)，則轉(zhuǎn)化效率迅速下降。

2.3 電擊前后冰浴時(shí)間 在進(jìn)行電轉(zhuǎn)化前，通常不需要把DNA提前加到細(xì)胞懸液中。據(jù)報(bào)道，DNA在進(jìn)入細(xì)胞之前并不需要結(jié)合到細(xì)胞表面［7，8］，而且在菌液中預(yù)先加入的DNA還有可能被感受態(tài)細(xì)胞分泌的核酸酶的降解。張洋等［11］采用大腸埃希菌DH10B研究了轉(zhuǎn)化前的冰浴時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，冰浴時(shí)間0～30 min對(duì)轉(zhuǎn)化效率無(wú)顯著影響，即DNA分子與細(xì)胞表面的結(jié)合(或充分靠近)并不是必需的，也可能混合完全后的質(zhì)粒DNA和感受態(tài)細(xì)胞已經(jīng)完成了結(jié)合過(guò)程(或距離已經(jīng)充分接近)。韓峰等［9］也證實(shí)電擊前將感受態(tài)細(xì)胞在冰上靜置0～30 min對(duì)轉(zhuǎn)化效率影響不大，在最初的5 min內(nèi)轉(zhuǎn)化效率稍有提高，但隨后的25 min內(nèi)則呈下降趨勢(shì)。電擊后在加入培養(yǎng)基前的冰浴時(shí)間不同(0～30 min)，對(duì)轉(zhuǎn)化效率影響顯著，在冰浴1 min內(nèi)轉(zhuǎn)化效率就呈現(xiàn)大幅度下降，10 min后幾乎降至最低點(diǎn)，只有不冰浴的20%。

2.4 脈沖信號(hào)持續(xù)時(shí)間 電脈沖信號(hào)音響后持續(xù)不同時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率有較大影響。張建瓊等［12］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，電脈沖音響后持續(xù)2 s較信號(hào)音響后即停和信號(hào)音響后持續(xù)3 s轉(zhuǎn)化效率明顯增加。

2.5 樣品鹽離子成分 如果樣品中鹽離子濃度過(guò)高時(shí)，導(dǎo)電能力增強(qiáng)，放電兩極之間形成低電阻通路，瞬間電流急劇增加，產(chǎn)生無(wú)效放電或旁路放電，不能使菌體胞膜產(chǎn)生孔洞，同時(shí)，瞬間強(qiáng)電流導(dǎo)致電擊體系溫度驟然升高，大量細(xì)菌死亡，引起轉(zhuǎn)化效率顯著下降，甚至引起電擊穿現(xiàn)象，造成實(shí)驗(yàn)失敗。方勤等［13］研究發(fā)現(xiàn)，采用乙醇沉淀法可有效去除連接產(chǎn)物中的鹽分，有利于提高轉(zhuǎn)化效率。然而，包其郁等［14］對(duì)1 μL各含0.01 ng或0.001 ng pUC18 DNA的1×連接反應(yīng)混合物進(jìn)行乙醇沉淀處理后，轉(zhuǎn)化效率反而降低至1/10～1/100，因此認(rèn)為乙醇沉淀法不能有效地提高轉(zhuǎn)化效率。在微量DNA狀態(tài)時(shí)，由于處理過(guò)程中造成DNA的丟失反而使轉(zhuǎn)化效率降低。此外，稀釋法、透析法也能有效降低樣品鹽離子濃度，但稀釋法不利于小體積轉(zhuǎn)化的要求;透析法回收率較低。因此，急需研究開(kāi)發(fā)一種純化回收微量質(zhì)粒DNA的簡(jiǎn)便而有效的方法。

2.6 抗生素濃度 李南等［5］在用質(zhì)粒pFab74X電轉(zhuǎn)化大腸埃希菌TG1時(shí)發(fā)現(xiàn)，將選擇培養(yǎng)基中氨芐青霉素的濃度從100 mg/L降至20 mg/L，可使轉(zhuǎn)化效率上升約5倍。其可能原因是電穿孔后的細(xì)胞雖然經(jīng)過(guò)短時(shí)間的恢復(fù)培養(yǎng)，但仍然比較脆弱，適當(dāng)降低選擇性培養(yǎng)基中抗生素濃度，有利于轉(zhuǎn)化菌的抗性基因的充分表達(dá)，可以進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化效率。韋曉明等［6］在探索大腸埃希菌XL1-Blue電轉(zhuǎn)化條件時(shí)，分別用含氨芐青霉素100、50、20 mg/L的培養(yǎng)板篩選轉(zhuǎn)化菌，結(jié)果表明，氨芐青霉素濃度為100 mg/L時(shí)的轉(zhuǎn)化率是50 mg/L時(shí)的1/2，是20 mg/L時(shí)的1/3。

2.7 電擊溫度 電擊時(shí)產(chǎn)熱可直接影響感受態(tài)細(xì)胞的存活率，因此需要特別注意保持菌液的溫度。電轉(zhuǎn)化時(shí)樣品的開(kāi)始溫度對(duì)轉(zhuǎn)化效率影響很大，如大腸埃希菌在0～4℃進(jìn)行電擊的轉(zhuǎn)化效率比在室溫下至少提高100倍［8］。

3 質(zhì)粒大小、用量及構(gòu)象

3.1 質(zhì)粒大小 質(zhì)粒的大小直接影響轉(zhuǎn)化效率。由于需要導(dǎo)入細(xì)菌的質(zhì)粒長(zhǎng)度遠(yuǎn)大于電穿孔所導(dǎo)致的細(xì)胞空洞，因此質(zhì)粒只能沿長(zhǎng)軸方向通過(guò)擴(kuò)散導(dǎo)入細(xì)胞。短質(zhì)粒較之長(zhǎng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化率高的原因?yàn)?電擊后，在細(xì)胞孔道重新閉合前的數(shù)秒內(nèi)，短質(zhì)粒完全進(jìn)入細(xì)胞的數(shù)目較長(zhǎng)質(zhì)粒多，進(jìn)而形成較多的轉(zhuǎn)化菌落;而長(zhǎng)質(zhì)粒來(lái)不及完全進(jìn)入菌體細(xì)胞內(nèi)，致使獲得的轉(zhuǎn)化菌落較少［15］。

3.2 質(zhì)粒用量 電轉(zhuǎn)化時(shí)的質(zhì)粒DNA用量在很大范圍內(nèi)和轉(zhuǎn)化子數(shù)呈線形關(guān)系。研究表明，電轉(zhuǎn)化大腸埃希菌時(shí)，質(zhì)粒DNA用量在10～7.5 mg/L范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化子數(shù)和DNA用量呈線型關(guān)系，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)109個(gè)/μg DNA以上［8］。但在相同的轉(zhuǎn)化體積中(細(xì)胞數(shù)相同)DNA用量愈多，轉(zhuǎn)化子數(shù)也愈多，即轉(zhuǎn)化效率(轉(zhuǎn)化子數(shù)/存活細(xì)胞數(shù))和DNA濃度呈正相關(guān)。

3.3 質(zhì)粒構(gòu)象 質(zhì)粒DNA的構(gòu)象對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響非常明顯，超螺旋質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率遠(yuǎn)高于線型和開(kāi)環(huán)質(zhì)粒，因此用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒中超螺旋狀態(tài)DNA分子的比例至少應(yīng)達(dá)到2/3［16］。

文獻(xiàn)報(bào)道的不同菌株電轉(zhuǎn)化條件不統(tǒng)一，由于菌株細(xì)胞壁厚薄、細(xì)胞大小及形狀等因素影響造成菌株對(duì)電轉(zhuǎn)化的耐受性及敏感程度不同，其在電轉(zhuǎn)化時(shí)所采用的條件也各不相同。因此，在對(duì)新菌株進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)化時(shí)，有必要探索其最佳轉(zhuǎn)化條件。

4 小結(jié)

目前電穿孔技術(shù)的應(yīng)用范圍得到不斷拓展，例如，將該技術(shù)用于核酸疫苗的轉(zhuǎn)遞［17，18］;通過(guò)質(zhì)?；蛲鈦?lái)基因轉(zhuǎn)染原生動(dòng)物［19］;非熱效應(yīng)殺滅腫瘤細(xì)胞［20］;向正常組織或腫瘤組織中轉(zhuǎn)入治療性蛋白基因［21，22］;向組織中轉(zhuǎn)入生長(zhǎng)因子基因，促進(jìn)組織再生［23］;基因剔除［24］等。隨著國(guó)內(nèi)外對(duì)電穿孔技術(shù)的研究日益深入，其在生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)⒂兄浅V闊的應(yīng)用前景。

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