穆淑梅，楊炎，2，孫世杰，康現(xiàn)江

（1.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002；2.華北制藥金坦生物技術(shù)股份有限公司 生物產(chǎn)品中心，河北 石家莊 050035）

中華鋸齒米蝦卵黃蛋白的純化鑒定

穆淑梅1，楊炎1，2，孫世杰1，康現(xiàn)江1

（1.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002；2.華北制藥金坦生物技術(shù)股份有限公司 生物產(chǎn)品中心，河北 石家莊 050035）

為了研究中華鋸齒米蝦卵黃蛋白的性質(zhì)，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用不同的染色方法對(duì)其進(jìn)行分析鑒定，并采用電泳洗脫法從中華鋸齒米蝦成熟卵巢中將其分離純化.研究結(jié)果表明，中華鋸齒米蝦成熟卵巢中的卵黃蛋白為糖脂復(fù)合蛋白，該蛋白分子質(zhì)量為434ku.利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)分析該卵黃蛋白由3個(gè)主要亞基組成，分子質(zhì)量分別為108，89，78ku.

中華鋸齒米蝦；卵黃蛋白；電泳洗脫；純化；鑒定

卵生動(dòng)物中，卵黃生成是卵母細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的一個(gè)重要步驟，也是一個(gè)營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)備的過(guò)程，將蛋白質(zhì)、脂肪、糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)儲(chǔ)存到卵子中以備胚胎發(fā)育之需［1-2］.而卵子中卵黃的主要成分是卵黃蛋白（vitellin，Vn），因此，該蛋白的合成也就成為考察雌性動(dòng)物生殖能力的一個(gè)很好的指標(biāo).雌性動(dòng)物中，卵黃蛋白原（vitellogenin，Vg）是卵黃蛋白的前體，產(chǎn)生之后經(jīng)由血淋巴運(yùn)送到卵母細(xì)胞，經(jīng)過(guò)一系列修飾及分解作用轉(zhuǎn)化成卵黃蛋白，與卵黃蛋白有著免疫同一性［3］.

卵黃蛋白（原）通常僅存在于雌性動(dòng)物中，但是現(xiàn)在也有其在雄性動(dòng)物中出現(xiàn)的報(bào)道，這通常與動(dòng)物的內(nèi)分泌紊亂或環(huán)境激素引發(fā)的不良效應(yīng)有關(guān)［2，4］.因此，卵黃蛋白（原）的存在也常用于研究激素參與的生殖調(diào)控［1］以及評(píng)估環(huán)境激素引發(fā)的不良生理效應(yīng)［2，4-5］等方面.那么，在研究卵黃蛋白的合成以及激素（外源、內(nèi)源）的調(diào)控（影響）作用之前，有必要對(duì)卵黃蛋白進(jìn)行分離純化和性質(zhì)研究，為后續(xù)的抗體制備以及在此基礎(chǔ)之上所做的上述研究提供基礎(chǔ)資料.

目前有關(guān)甲殼動(dòng)物卵黃蛋白性質(zhì)的研究國(guó)內(nèi)外已有很多的報(bào)道，已經(jīng)分離出日本對(duì)蝦（Penaeus japonicus）［6］、斑節(jié)對(duì)蝦（P.monodon）［7］、短溝對(duì)蝦（P.semisulcatus）［8］、南美白對(duì)蝦（P.vannamei）［8］、凡納濱 對(duì) 蝦 （Litopenaeusmerguiensis）［9］、克 氏 原 螯 蝦 （Procambiusclarkii）［10］、紅 螯 光 殼 螯 蝦 （Cherax quadricarinatus）［11］、日本沼蝦（Macrobrachiumnipponense）［12］、羅氏沼蝦（M.rosenbergii）［13］等種類(lèi)的卵黃蛋白.卵黃蛋白的提純方法主要有高效液相色譜儀法、密度梯度離心法、蔗糖-EDTA-硫酸銨沉淀法、凝膠過(guò)濾-陰離子交換層析法、電泳洗脫法等.

本實(shí)驗(yàn)以中華鋸齒米蝦為實(shí)驗(yàn)材料，采用電泳洗脫法從其成熟卵巢中分離純化卵黃蛋白，利用梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳和SDS-PAGE分析卵黃蛋白的性質(zhì)，為卵黃蛋白的合成等研究提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用中華鋸齒米蝦購(gòu)自河北安新，產(chǎn)于白洋淀天然水體.選取卵巢發(fā)育成熟的中華鋸齒米蝦，冰浴條件下將其解剖，迅速取出卵巢備用.

1.2 試劑

天然高分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白：Bovine serum albumin（67ku），Lactate dehydrogenase（140ku），Catalase（232ku），F(xiàn)erritin（440ku），Thyroglobulin（669ku），Pharmaica.

SDS-高分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白：Glutamate dehydrogenase（53ku），Transferrin （76ku），β-Galactosidase（116ku），α-2-Macroglobulin（170ku），Myosin（220ku），Pharmaica.

1.3 儀器

JA2003電子天平，上海精科；Phs-3C酸度計(jì)，上海偉業(yè)儀器廠；Sigma 2-16K高速冷凍離心機(jī)；DYY-Ⅲ6B恒流穩(wěn)壓電泳儀、DYC-Z24D電泳槽、DYC-Z40A回收電泳槽，均為北京六一儀器廠產(chǎn)品；Uniscan B880掃描儀，清華紫光股份有限公司.

1.4 方法

1.4.1 卵巢粗提液的制備

取中華鋸齒米蝦成熟卵巢，電子天平上稱(chēng)取0.5g，加入5mL預(yù)冷的蛋白提取液（0.5mol／L Tris-HCl，2mmol／L EDTA，0.1mol／L NaCl，0.1mmol／L PMSF，pH 7.4）勻漿.將勻漿液離心15min（4℃，10 000r／min），棄除上層油脂和下層沉淀，余者即為卵巢粗提液.

1.4.2 卵黃蛋白的鑒定

非變性條件下聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）分析其卵巢粗提液，所用分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%，pH 8.9.電泳結(jié)束，將膠板縱向分為3部分，分別進(jìn)行糖蛋白染色（過(guò)碘酸-Schiff's試劑），脂蛋白染色（蘇丹黑B）以及考馬斯亮藍(lán)染色，分析蛋白性質(zhì)［12］.

1.4.3 電泳洗脫純化卵黃蛋白

成熟卵巢粗提液進(jìn)行PAGE電泳（分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%，pH 8.9）后，采用電泳洗脫法對(duì)其卵黃蛋白進(jìn)行純化［12］.

1.4.4 電泳分析卵黃蛋白分子質(zhì)量

采用梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳（分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%～15%，pH 8.9）分析上述純化卵黃蛋白的分子質(zhì)量，加入天然高分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白.

1.4.5 電泳分析卵黃蛋白亞基性質(zhì)

SDS-PAGE（分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%，pH 8.9）分析該卵黃蛋白亞基數(shù)目及分子質(zhì)量.用還原樣品緩沖液（含體積分?jǐn)?shù)5% 的β-巰基乙醇和質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% 的SDS）處理樣品，加樣前沸煮10min，同時(shí)加入SDS-高分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白.

2 結(jié)果

2.1 卵黃蛋白的鑒定與純化

PAGE分析中華鋸齒米蝦成熟卵巢粗提液，結(jié)果顯示考馬斯亮藍(lán)、糖蛋白、脂蛋白3種染色方法同時(shí)呈現(xiàn)陽(yáng)性的蛋白帶僅1條，而且遷移位置也一致（圖1）.其他學(xué)者的研究結(jié)果證實(shí)，甲殼動(dòng)物的卵黃蛋白為具有高分子質(zhì)量的糖脂復(fù)合蛋白，所以可以確定本實(shí)驗(yàn)中的這條3種染色均為陽(yáng)性的蛋白帶即為中華鋸齒米蝦成熟卵巢中的卵黃蛋白.而在這條卵黃蛋白條帶下方還有一條考馬斯亮藍(lán)深染的蛋白條帶（圖1a），但脂蛋白和糖蛋白染色均呈陰性（圖1b，c），說(shuō)明此蛋白非糖脂蛋白，同時(shí)證明染色鑒定卵黃蛋白的結(jié)果是可信的.此外，由于卵黃蛋白上結(jié)合有類(lèi)胡蘿卜素，所以在電泳過(guò)程中和電泳結(jié)束后，可在凝膠上看到一條較淺的橙黃色條帶.這一結(jié)果與柳峰松等［14］的研究結(jié)果一致.

圖1 中華鋸齒米蝦卵巢粗提液聚丙烯酰胺凝膠電泳后卵黃蛋白的鑒定Fig.1 Identifying Vn from the matured ovaries of Neocaridinadenticulatasinensis via native PAGE

將電泳洗脫純化所得樣品進(jìn)行PAGE驗(yàn)證，考馬斯亮藍(lán)以及脂蛋白、糖蛋白特異染色結(jié)果均呈陽(yáng)性（圖2），說(shuō)明純化所得樣品即為卵黃蛋白.

圖2 純化卵黃蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳后的不同染色結(jié)果Fig.2 Native PAGE for the purified Vn with different staining means

2.2 卵黃蛋白及其亞基性質(zhì)分析

梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳分析已純化的卵黃蛋白，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線確定其分子質(zhì)量為434ku（圖3）.經(jīng)SDS-PAGE分析，確定該蛋白由3個(gè)主要亞基組成，分子質(zhì)量分別為108，89，78ku（圖4）.

圖3 梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳分析卵黃蛋白的分子質(zhì)量Fig.3 Gradient PAGE for the molecular mass of Vn

圖4 SDS-聚丙烯凝膠電泳分析卵黃蛋白亞基及其分子質(zhì)量Fig.4 SDS-PAGE for the subunits and the molecular mass

3 討論

目前對(duì)已經(jīng)分離出的甲殼動(dòng)物卵黃蛋白的研究一致認(rèn)為，卵黃蛋白是一種高分子質(zhì)量的糖脂蛋白，因此，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)其這一特性，PAGE電泳后，通過(guò)糖蛋白、脂蛋白特異染色，對(duì)比考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果，分析確定了中華鋸齒米蝦成熟卵巢粗提液中的卵黃蛋白，隨后采用電泳洗脫法對(duì)該蛋白進(jìn)行了分離純化.電泳洗脫法對(duì)于樣品中含量豐富的蛋白（如甲殼動(dòng)物成熟卵巢中的卵黃蛋白）的回收純化是一種簡(jiǎn)便而快捷的方法，且提純的蛋白純度較高，比較適用于蛋白質(zhì)的氨基酸組成分析、分子質(zhì)量及亞基組成等性質(zhì)分析的研究.

實(shí)驗(yàn)中采用聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳以及SDS-PAGE的方法，分別分析了中華鋸齒米蝦成熟卵巢中卵黃蛋白的總分子質(zhì)量及其亞基組成和各亞基分子質(zhì)量.中華鋸齒米蝦成熟卵巢中存在1種卵黃蛋白，其分子質(zhì)量為434ku，該蛋白由3個(gè)主要的亞基組成，分子質(zhì)量分別為108，89，78ku.由結(jié)果可以看出，3個(gè)亞基分子質(zhì)量之和與卵黃蛋白分子質(zhì)量稍有差距，但是，這在關(guān)于甲殼動(dòng)物卵黃蛋白的性質(zhì)研究中是非常普遍的現(xiàn)象［6-13］，如謝松等［10］同樣采用電泳回收的方法對(duì)克氏原螯蝦的卵黃蛋白進(jìn)行了純化，聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳分析其總分子質(zhì)量為481ku，SDS-PAGE結(jié)果顯示該蛋白具有6個(gè)亞基，分子質(zhì)量分別為198，176，132，111，92，82ku.究其原因，可能與分析蛋白分子質(zhì)量的方法有關(guān).在已有的研究中，通常均采用SDSPAGE來(lái)分析各物種卵黃蛋白的亞基組成及分子質(zhì)量［6-13］.SDS-PAGE分析蛋白分子質(zhì)量的原理在于SDS所帶的大量負(fù)電荷，消除或掩蓋了與其結(jié)合的不同種類(lèi)蛋白質(zhì)間原有電荷的差異，從而利用分子質(zhì)量差異將各種蛋白質(zhì)分開(kāi).但是SDS-PAGE亦有不足之處，如對(duì)于帶有較大輔基的蛋白（糖蛋白、脂蛋白等），由于它們的側(cè)鏈會(huì)直接影響蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合后的形狀，故不能確保電泳遷移率與蛋白分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)間的線性關(guān)系［15］.但由于SDS-PAGE檢測(cè)簡(jiǎn)便快捷，所以仍是目前研究分析卵黃蛋白亞基分子質(zhì)量的首選.

研究甲殼動(dòng)物卵黃蛋白，最終目的是要了解其合成積累機(jī)理，對(duì)卵黃蛋白的純化鑒定則是這一工作的前提.通過(guò)分離純化卵黃蛋白來(lái)制備其特異性抗體，由于卵黃蛋白與其前體卵黃蛋白原具有免疫同一性，該抗體可用以檢測(cè)卵黃蛋白原的發(fā)生以及卵黃蛋白的積累部位，探討其合成機(jī)理，了解相關(guān)激素的內(nèi)分泌調(diào)控機(jī)制，為在養(yǎng)殖過(guò)程中實(shí)現(xiàn)親本促熟提供科學(xué)依據(jù).

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Purification and Identification of Vitellin inNeocaridinadenticulatasinensis

MU Shu-mei1，YANG Yan1，2，SUN Shi-jie1，KANG Xian-jiang1
（1.College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，China；2.Center of Biological Products，North China Pharmaceutical Group Corporation（NCPC）GeneTech Biotechnology Development Co.Ltd.，Shijiazhuang 050035，China）

In order to investigate the properties of vitellin（Vn），Vn from the matured ovaries ofNeocaridinadenticulatasinensiswas purified by electroelution and characterized by native polyacrylamide gel electrophoresis（PAGE），gradient PAGE and SDS-PAGE.The results indicated that Vn was a lipoglycoprotein with a molecular mass of 434ku and contained three major subunits（108，89，78ku）.

Neocaridinadenticulatasinensis；vitellin；electroelution；purification；identification

Q 959.223

A

1000-1565（2011）06-0638-05

2011-04-10

河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（C2011201028）；保定市科學(xué)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（10ZN008）

穆淑梅（1972-），女，河北曲陽(yáng)人，河北大學(xué)講師，主要從事動(dòng)物生殖毒理學(xué)研究.

康現(xiàn)江（1964-），男，河北邯鄲人，河北大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物生殖生物學(xué)方面的研究.

E-mail：xjkang＠hbu.edu.cn

趙藏賞）