譚安雄，朱耀斌，王玉銀

(1.邵陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校藥學(xué)系，湖南邵陽(yáng) 422000;2.湖南交通醫(yī)院藥劑科，長(zhǎng)沙 410006;3.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410011)

西紅花酸(crocetin)是西紅花的主要有效成分之一，具有多不飽和共軛烯酸結(jié)構(gòu)，屬類(lèi)胡蘿卜素物質(zhì)。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)［1-3］報(bào)道西紅花酸具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、改善糖尿病血管病變、抗凝血和抗血栓等作用，對(duì)心肌缺血損傷有保護(hù)作用。西紅花酸對(duì)心肌缺血損傷有保護(hù)作用，筆者推測(cè)其對(duì)缺血性腦血管疾病也有一定作用，觀察西紅花酸對(duì)腦缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠120只，體質(zhì)量260～320 g，購(gòu)自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證:SCXK(滬)200920056。

1.2 藥物及試劑 西紅花酸(廣州佳科生物科技有限公司產(chǎn)品，批號(hào):09031210，規(guī)格:每支10 mg);尼莫地平(山東濰坊制藥有限公司產(chǎn)品，批號(hào):090218，規(guī)格:每支5 mg)。丙二醛(malonaldehyde，MDA)測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測(cè)定試劑盒、一氧化氮(nitrogen monoxidum，NO)測(cè)定試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)，北京化學(xué)試劑公司生產(chǎn)。

1.3 動(dòng)物分組與給藥 120只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后隨機(jī)分成6組，即假手術(shù)組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組(分別給予尼莫地平溶液5 mg·kg-1)及低、中、高劑量藥物組(給予西紅花酸10，20，40 mg·kg-1)，每組20只。假手術(shù)組、模型組給予等容量0.9%氯化鈉溶液。各組大鼠均于每日上午灌胃給予0.9%氯化鈉溶液或相應(yīng)藥物，每天給藥1次，連續(xù)給藥7次。

1.4 大鼠局灶性腦缺血-再灌注模型的制備 末次給藥1 h后，參照文獻(xiàn)［4］，制備大鼠大腦中動(dòng)脈阻斷再灌注模型。用10%水合氯醛350 mg·kg-1腹腔注射麻醉大鼠，仰臥固定，消毒皮膚，頸部正中切開(kāi)，鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈。沿頸內(nèi)動(dòng)脈向下分離出翼腭動(dòng)脈，并結(jié)扎。用動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈，于頸外動(dòng)脈上距其始端約2 mm處剪一切口，將一端燙圓的魚(yú)線沿頸外動(dòng)脈緩慢插入至大腦中動(dòng)脈起始端，略感阻力時(shí)停止，插入長(zhǎng)度18～22 mm。阻斷中動(dòng)脈2 h，輕輕拔出魚(yú)線至頸外動(dòng)脈處，使大腦中動(dòng)脈恢復(fù)供血，再灌注22 h。假手術(shù)組大鼠分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及翼腭動(dòng)脈，結(jié)扎翼腭動(dòng)脈，但不插魚(yú)線阻斷大腦中動(dòng)脈。

1.5 神經(jīng)損傷癥狀評(píng)分 再灌注22 h，每組取10只大鼠。采用ZeaLonga評(píng)分法進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評(píng)分。0分:未觀察到神經(jīng)功能缺陷癥狀，活動(dòng)正常;1分:不能完全伸展手術(shù)對(duì)側(cè)前肢;2分:爬行時(shí)出現(xiàn)向手術(shù)對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分:行走時(shí)身體向手術(shù)對(duì)側(cè)傾倒;4分:不能自發(fā)行走，昏迷;5分:死亡。

1.6 腦梗死體積比例測(cè)定 神經(jīng)功能行為缺陷評(píng)分后將大鼠斷頭取出全腦，取缺血側(cè)大腦，去除小腦、低位腦干和嗅球，將右腦沿冠狀面切成厚度基本相同的5片，腦片置于2%TTC溶液2mL中避光孵育30 min。再將腦片置10%甲醛中固定。數(shù)碼相機(jī)攝相后，應(yīng)用圖像分析儀，測(cè)量腦梗死體積比例。

1.7 缺血腦組織中MDA和NO的含量、SOD活性測(cè)定 再灌注22 h后，每組取大鼠10只，斷頭處死，取缺血側(cè)皮質(zhì)組織，用0.9%氯化鈉溶液制備10%腦組織勻漿。按照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定大腦組織中MDA、NO的含量及SOD活性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間比較采用 LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 西紅花酸對(duì)大鼠神經(jīng)癥狀的影響 假手術(shù)組無(wú)神經(jīng)癥狀，模型組有明顯神經(jīng)癥狀，西紅花酸和尼莫地平能明顯降低大鼠神經(jīng)缺陷評(píng)分，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或 P＜0.01)，見(jiàn)表1。

2.2 西紅花酸對(duì)缺血-再灌注大鼠腦梗死體積的影響 與假手術(shù)組比較模型組大鼠腦梗死范圍明顯(P＜0.01)。西紅花酸和尼莫地平明顯降低大鼠腦梗死范圍，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，見(jiàn)表1。

表1 6組大鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分和腦梗死體積比例Tab．1 The nerve functional defect score and rate of cerebral infarction volume of rats in six groups± s，n=10

表1 6組大鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分和腦梗死體積比例Tab．1 The nerve functional defect score and rate of cerebral infarction volume of rats in six groups± s，n=10

與模型組比較，*1 P＜0.01，*2 P＜0.05;與假手術(shù)組比較，*3 P＜0.01Compared with the model group，*1 P ＜ 0.01，*2 P ＜ 0.05;Compared with sham operation group，*3 P ＜0.01

組別 劑量/(mg·kg-1)神經(jīng)功能缺陷評(píng)分/分腦梗死體積比例/%西紅花酸高劑量藥物組 40 0.35±0.31*1 13.2±4.3*1中劑量藥物組 20 1.21±0.54*2 21.6±3.5*2低劑量藥物組 10 2.04±0.32 34.2±2.7尼莫地平組 5 1.29±0.42*2 20.6±4.2*2假手術(shù)組 … 0.00±0.00 0.0±0.0模型組 … 2.12±0.64*3 44.8±3.2*3

2.3 西紅花酸對(duì)大鼠缺血腦組織MDA、NO含量的影響 模型組大鼠腦內(nèi)MDA、NO明顯增多，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。西紅花酸和尼莫地平能明顯降低大鼠腦內(nèi)MDA、NO含量，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，見(jiàn)表2。

2.4 西紅花酸對(duì)大鼠缺血腦組織SOD活性的影響模型組大鼠腦組織SOD活性與假手術(shù)組比較明顯降低(P＜0.01)。西紅花酸和尼莫地平能明顯增加大鼠腦內(nèi)SOD活性，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，見(jiàn)表2。

表2 6組大鼠缺血腦組織MDA、NO含量及SOD活性Tab．2 The content of MDA，NO and the activity of SOD in ischem ic brain tissues of rats in six groups ±s

表2 6組大鼠缺血腦組織MDA、NO含量及SOD活性Tab．2 The content of MDA，NO and the activity of SOD in ischem ic brain tissues of rats in six groups ±s

與模型組比較，*1 P＜0.01，*2 P＜0.05;與假手術(shù)組比較，*3 P＜0.01Compared with themodel group，*1 P ＜0.01，*2 P ＜0.05;Compared with sham operation group，*3 P ＜0.01

組別 劑量/(mg·kg-1)大鼠/只MDA NO μmol·g-1 SOD/(kU·g-1)西紅花酸高劑量藥物組 40 10 2.0±0.5*1 5.8±1.5*1 198.3±13.1*1中劑量藥物組 20 10 2.9±0.4*2 8.8±1.3*2 159.8±10.9*2低劑量藥物組 10 10 3.8±0.7 10.8±2.3 132.4±12.1尼莫地平組 5 10 2.5±0.8*3 8.8±2.1*3 164.3±10.7*3假手術(shù)組 … 10 2.1±0.6 6.3±1.1 202.6±12.5模型組 … 10 4.2±0.7*3 12.8±1.3*2 121.1±11.6*2

3 討論

腦缺血-再灌注損傷的機(jī)制十分復(fù)雜，目前的研究表明其涉及興奮性氨基酸毒性、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、氧自由基毒性、炎性損傷及凋亡的表達(dá)等，其中氧自由基在腦缺血-再灌注損傷中占有重要地位。腦缺血-再灌注所產(chǎn)生氧自由基通過(guò)作用于細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸，使細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，使質(zhì)膜破壞和功能障礙;氧自由基可使蛋白質(zhì)的巰基氧化，形成二硫鍵，直接損傷蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，抑制蛋白質(zhì)的功能;氧自由基還可使DNA斷裂，破壞核酸及染色體的結(jié)構(gòu)和功能。

腦缺血-再灌注后，大量的氧分子為黃嘌呤氧化酶的核苷酸代謝提供了底物，導(dǎo)致過(guò)氧化氫和超氧化物過(guò)量產(chǎn)生，自由基清除酶活性降低，消除自由基的功能減弱，使自由基與清除自由基酶之間的平衡失調(diào)。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化物中的主要產(chǎn)物，測(cè)定MDA可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度。SOD為抗氧化酶，是體內(nèi)主要的自由基清除劑，能催化超氧自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。SOD活力的高低反應(yīng)機(jī)體清除氧自由基的能力，常作為清除氧自由基能力的主要指標(biāo)。因此，通過(guò)測(cè)定SOD、MDA可反映腦缺血-再灌注后自由基對(duì)腦組織的損傷情況［5］。

NO在腦缺血發(fā)病過(guò)程中有雙重作用［6］。缺血早期血管內(nèi)皮細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶(cNOS)介導(dǎo)產(chǎn)生少量的NO，可擴(kuò)張血管和抑制血小板聚集，改善腦組織灌流，對(duì)缺血腦組織有保護(hù)作用。再灌注時(shí)，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)介導(dǎo)產(chǎn)生大量的NO則具有神經(jīng)毒性，可直接或者通過(guò)其衍生物導(dǎo)致能量耗竭，損害DNA，抑制DNA合成，誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡。NO可與氧自由基協(xié)同作用，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載、興奮性氨基酸細(xì)胞毒性作用和酸中毒等一系列變化，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷。

本實(shí)驗(yàn)顯示，模型組大鼠腦缺血-再灌注后出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能障礙、腦梗死范圍大，MDA、NO含量增加，SOD活性降低。西紅花酸治療組與模型組比較，神經(jīng)功能明顯改善、腦梗死范圍明顯減小，MDA、NO含量降低，SOD活性增加。表明西紅花酸對(duì)腦缺血-再灌注損傷有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與提高腦內(nèi)SOD的活性和降低腦內(nèi)MDA、NO含量有關(guān)。

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