程麗娟，陳曉農(nóng)，劉青川，徐雪鈺，蘇成虎，于珊，黃正明

(1.北京化工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，100029;2.解放軍第302醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100039;3.解放軍第309醫(yī)院藥劑科，北京 100091)

靈五顆粒(lingwu granules，LW)是由菌草靈芝、五味子等組成，臨床用于治療慢性乙型肝炎，具有扶正活血、疏肝利膽、保肝降酶等功效，主治慢性傳染性乙型肝炎引起的肝功能［丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)］異常，早期肝纖維化，肝硬化致腹腔積液，殘黃(血清膽紅素升高)等癥。為了將其研發(fā)為使用方便的現(xiàn)代制劑，筆者采用了現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，將臨床應(yīng)用多年的菌草靈芝、五味子等方藥精制成了口服方便的顆粒制劑。由于LW對慢性乙型肝炎治療有效，在先期LW對D-半乳糖胺致小鼠急性肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷具有明顯的保肝降酶作用［1］的基礎(chǔ)上，筆者在本研究選用以四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)誘導(dǎo)大鼠慢性肝損傷(早期纖維化)為模型，進(jìn)一步對LW防治慢性肝損傷的作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，并對其可能的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 兩批實(shí)驗(yàn)Wistar大鼠(SPF級)共90只。實(shí)驗(yàn)開始時大鼠體質(zhì)量150～170 g，雄性。第1批大鼠購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物合格證號:SCXK(京)2006-0009;第2批購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院五所，動物合格證號:SCXK-(軍)2007-004。大鼠飼養(yǎng)于解放軍第302醫(yī)院標(biāo)準(zhǔn)封閉式清潔級(二級)動物房內(nèi)飼養(yǎng)，由獲得資格認(rèn)可的人員飼養(yǎng)。大鼠在實(shí)驗(yàn)過程中自由攝食。

1.1.2 藥品、試劑盒 LW顆粒(解放軍第302醫(yī)院自制，批號:20091225)，六味五靈片(山東世博金都藥業(yè)有限公司，批號:100110)，苯巴比妥片(上海信誼藥廠有限公司，批號:091001)，CCl4(分析純，批號:20080421)，橄欖油(北京古船油脂有限責(zé)任公司)。丙二醛(malonaldehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、組織蛋白、羥脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)試劑盒購于南京建成生物工程研究所;ALT、AST、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、清蛋白(albumin，ALB)、總蛋白(total protein，TP)試劑盒購于深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

1.1.3 儀器 BS-120全自動生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)，DY89-Ⅱ型電動玻璃勻漿機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)，722型可見光分光光度計(上海元析儀器有限公司)，TGL-16G離心機(jī)(飛鴿牌系列離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠)，85-2型恒溫磁力攪拌器(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)，渦旋混勻器(其林貝爾儀器制造公司)，XMTB-608型水浴鍋(余姚市長江溫度儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 健康Wistar大鼠90只(兩批實(shí)驗(yàn)大鼠總和)，購來適應(yīng)3 d后，隨機(jī)分為6組，第1批48只，每組8只，第2批42只，每組7只，即正常組，模型組，陽性對照組(給予六味五靈片0.81 g·kg-1);高、中、低劑量藥物組(給予 LW 顆粒 7.00，3.50，1.75 g·kg-1)。

1.2.2 誘導(dǎo)肝藥酶、造模及給藥 正常組自由飲水，其余5組給予350 mg·L-1苯巴比妥水溶液，飲用2周。實(shí)驗(yàn)第3周開始，造模并給藥。首次致毒劑量為0.08 mL，以后按0.8 mL·(100 g)-1體質(zhì)量灌胃50%CCl4橄欖油溶液致毒，每周1次，連續(xù)5周;正常組灌胃橄欖油作為溶劑對照。自造模之日開始，灌胃給藥，qd，連續(xù)5周，正常組和模型組灌胃0.9%氯化鈉溶液作為空白對照。

1.2.3 取材 末次給藥后，大鼠禁食不禁水，16 h后稱定質(zhì)量全部處死，股動脈取血，并迅速取肝臟、脾、胸腺稱定質(zhì)量，從肝左中葉剪一小塊組織，用10%甲醛固定，供組織病理學(xué)檢查;另剪取一塊肝組織于冰0.9%氯化鈉溶液中漂洗除去血液，濾紙吸干，稱取約0.2 g，放入玻璃勻漿管，加冰氯化鈉溶液2 mL，用勻漿機(jī)10 000～15 000 r·min-1研磨制備10%組織勻漿，用于氧化和抗氧化指標(biāo)的檢測。

1.2.4 血清生化指標(biāo)的檢測 用BS-120全自動生化儀檢測血清中ALB、TP含量和AST、ALT、ALP活性。

1.2.5 肝組織生化指標(biāo)檢測 肝組織中Hyp、MDA含量檢測及SOD活力檢測用相應(yīng)的試劑盒，具體操作按試劑盒要求。

1.2.6 血清和肝臟中生化指標(biāo)改變率的計算 生化指標(biāo)改變率(%)=︱(模型對照組生化指標(biāo)平均值-給藥組生化指標(biāo)平均值)︱/(模型對照組生化指標(biāo)平均值)×100%。

1.2.7 臟器指數(shù)的計算 臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

1.2.8 肝臟組織學(xué)觀察 將10%甲醛固定好的肝組織送解放軍第302醫(yī)院病理科作組織切片，觀察并攝影。

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表達(dá)，用單因素多水平的方差分析處理數(shù)據(jù)，采用SPSS17.0軟件實(shí)施。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LW對慢性肝損傷大鼠血清中ALT、AST、ALP活性的影響 兩批實(shí)驗(yàn)血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果表明，模型組ALT、AST、ALP活性顯著高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，給予LW藥物干預(yù)后，酶活性降低。兩批實(shí)驗(yàn)中，高劑量藥物組ALT和ALP降低最為顯著(P＜0.01);AST降低第1批顯著(P＜0.05)，第2批差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。中劑量藥物組ALT、AST、ALP活性顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01或P ＜0.05);低劑量藥物組 ALT、AST、ALP活性也有顯著作用(P＜0.05或P＜0.01)。隨著LW給藥濃度的增大，對酶活性的抑制效果越明顯，呈現(xiàn)一定的量 效關(guān)系。見表1。

表1 6組大鼠血清中ALT、AST、ALP活性的檢測值Tab．1 The effects on the indexes of hepatic function of the chronic liver injury ratmodel in 6 groups U·L-1±s

表1 6組大鼠血清中ALT、AST、ALP活性的檢測值Tab．1 The effects on the indexes of hepatic function of the chronic liver injury ratmodel in 6 groups U·L-1±s

與模型組比較，*1 P＜0.01，*2 P＜0.05;與正常組比較，*3 P＜0.01Compared with themodel group，*1 P ＜0.01，*2 P ＜0.05;Compared with the normal group，*3 P ＜0.01

組別 劑量/(g·kg-1)ALT第1批(n=8) 第2批(n=7) 改變率/%AST第1批(n=8) 第2批(n=7) 改變率/%ALP第1批(n=8) 第2批(n=7) 改變率/%靈五高劑量組 7.00 31.18± 7.95*1 29.27± 6.02*1 52.8 122.93±16.79*2 95.61±19.11*1 30.0 110.91±15.57*1 217.44± 35.01*1 41.4靈五中劑量組 3.50 38.90± 7.19*1 31.23± 4.34*1 44.8 111.76±10.73*1 104.71±28.23*1 30.8 113.74±19.90*1 188.07± 22.57*1 43.0靈五低劑量組 1.75 40.83± 6.23*1 34.23± 6.10*1 41.1 129.85±10.79 115.76±18.88*1 21.4 116.04±21.41*2 172.00± 9.10*1 44.3陽性對照組 0.81 46.33±12.38 33.31± 3.61*1 37.0 125.15±36.59*2 91.94±16.78*1 30.4 112.98±28.56*2 201.47± 28.81*1 42.1模型組 … 58.37±16.69*3 71.29±18.47*3 0.0 152.98±13.13*3 159.77±38.96*3 0.0 141.35±13.32*3 560.07±148.05*3 0.0正常組 … 30.15± 1.42 27.69± 3.89 … 101.55±10.78 86.61±14.12 … 103.11±14.57 177.94±21.98…

2.2 LW對慢性肝損傷大鼠肝臟中Hyp含量的影響

兩批實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果表明，模型組與正常組比較，Hyp含量非常顯著性升高(P＜0.01)，與模型組比較，高劑量藥物組兩批實(shí)驗(yàn)Hyp含量均顯著降低(P＜0.01)，中、低劑量藥物組第1批實(shí)驗(yàn)對于降低Hyp含量有非常顯著的作用(P＜0.01)，其抑制率呈明顯劑量依賴性關(guān)系。見表2。

2.3 LW對慢性肝損傷大鼠血清ALB和TP的影響兩批實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果表明，模型組與正常組比較，血清中ALB、TP含量均顯著降低(P＜0.01)。與模型組比較，第1批實(shí)驗(yàn)ALB含量，陽性對照組和高、中劑量藥物組均明顯升高(P＜0.05)，低劑量藥物組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);TP含量，陽性對照組和高、中劑量藥物組均明顯升高(P＜0.05);第2批實(shí)驗(yàn)ALB和TP含量，陽性對照組和高劑量藥物組均明顯升高(P＜0.05)，中、低劑量藥物組均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，其抑制率提示有一定的劑量依賴性關(guān)系，見表3。

2.4 LW對慢性肝損傷大鼠肝臟氧化和抗氧化指標(biāo)的影響 兩批實(shí)驗(yàn)肝內(nèi)生化檢測結(jié)果表明，模型組與正常組比較，MDA含量顯著升高(P＜0.01或 P＜0.05)，SOD活力降低非常明顯(P＜0.01或P＜0.05)。給予LW治療后，高劑量藥物組MDA含量顯著降低(P＜0.05)，SOD活力明顯升高(P＜0.05)，中、低劑量藥物組對于降低MDA含量均有明顯作用，對于提高SOD活力沒有顯著作用，見表4。

表2 6組大鼠肝組織Hyp含量Tab．2 The Hyp content in hepatic tissue of rat in 6 groups ±s

表2 6組大鼠肝組織Hyp含量Tab．2 The Hyp content in hepatic tissue of rat in 6 groups ±s

與模型組比較，*1 P＜0.01，*2 P＜0.05;與正常組比較，*3 P＜0.01Compared with the model group，*1 P ＜ 0.01，*2 P ＜ 0.05;Compared with the normal group，*3 P ＜0.01

組別 劑量/(g·kg-1)Hyp/(μg·g-1)第1批(n=8) 第2批(n=7)改變率/%靈五高劑量組 7.00 330.34±42.10*1 152.90±14.33*1 45.1靈五中劑量組 3.50 341.17±68.87*1 187.11±26.36*2 34.7靈五低劑量組 1.75 351.73±48.14*1 217.72±23.21*2 28.1陽性對照組 0.81 406.89± 81.85*1 175.31±32.53*1 31.1模型組 … 560.86±111.66*3 268.07±49.82*3 0.0正常組 … 288.02±17.91 117.92±15.37…

表3 6組大鼠血清蛋白比較Tab．3 The comparison of protein content in the serum of rat in 6 groups g·L-1±s

表3 6組大鼠血清蛋白比較Tab．3 The comparison of protein content in the serum of rat in 6 groups g·L-1±s

與模型組比較，*1 P＜0.05;與正常組比較，*2 P＜0.01Compared with themodel group，*1 P ＜0.05;Compared with the normal group，*2 P ＜0.01

組別 劑量/(g·kg-1)ALB第1批(n=8) 第2批(n=7) 改變率/%TB第1批(n=8) 第2批(n=7) 改變率/%靈五高劑量組 7.00 48.18±2.08*1 48.56±2.42*1 1.95 78.03±2.96*1 77.84± 5.18*1 1.80靈五中劑量組 3.50 47.11±1.31*1 45.43±3.61 1.25 78.83±2.18*1 75.94± 7.43 3.05靈五低劑量組 1.75 45.33±3.70 45.97±0.92 -0.15 78.85±5.60 73.89± 2.05 1.70陽性對照組 0.81 49.95±2.28*1 47.34±2.69*1 6.40 78.91±3.65*1 76.31± 5.26*1 2.00模型組 … 45.61±1.50*2 45.81±2.28*2 0.00 75.34±2.41*2 74.83± 3.40*2 0.00正常組 … 50.34±2.36 52.93±5.68 … 85.50±6.99 87.96±12.17…

2.5 LW對慢性肝損傷大鼠臟器指數(shù)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常組比較，兩批實(shí)驗(yàn)的模型組大鼠肝、脾指數(shù)顯著升高(P＜0.01)，胸腺指數(shù)第1批降低不明顯(P＞0.05)，第2批降低明顯(P＜0.01)。給予LW治療后，第1批大鼠的肝指數(shù)有降低趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，高劑量藥物組脾指數(shù)治療后明顯降低(P＜0.05)，中、低劑量藥物組有降低趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，胸腺指數(shù)有升高趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);第2批大鼠的肝指數(shù)顯著降低(P＜0.01)，脾指數(shù)有升高趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，高、中劑量藥物組可顯著升高胸腺指數(shù)(P＜0.01)，低劑量藥物組明顯升高胸腺指數(shù)(P＜0.05)。以對臟器腫大(肝脾)和縮小(胸腺)的抑制率和增大率計算，低、中、高劑量藥物組與陽性對照組均顯示較好的效果，尤其高劑量藥物組效果最明顯，呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，見表5。

2.6 LW對CCl4致大鼠慢性肝損傷保護(hù)作用的病理觀察結(jié)果 光鏡下，正常動物組肝組織清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞呈放射狀排列，肝匯管區(qū)清楚;模型組肝組織模糊不清，肝小葉結(jié)構(gòu)完全破壞，大量的肝細(xì)胞脂肪變性，肝組織見明顯的纖維增生，匯管區(qū)大量的炎細(xì)胞浸潤;陽性對照組肝組織較清晰，肝小葉輪廓尚存，但結(jié)構(gòu)不清，大量的肝細(xì)胞脂肪變性，多見于大泡狀，并可見局灶性壞死，肝組織未見明顯的纖維增生，匯管區(qū)炎細(xì)胞浸潤;高劑量藥物組肝組織清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞有片狀脂肪性變，肝組織未見明顯的纖維增生，肝匯管區(qū)清楚;中劑量藥物組肝組織較清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)不完整，肝細(xì)胞脂肪性變，肝組織未見明顯的纖維增生，肝匯管區(qū)可見炎細(xì)胞浸潤;低劑量藥物組肝組織模糊不清，肝小葉輪廓不清，大量肝細(xì)胞呈脂肪性變，肝組織可見纖維增生，肝匯管區(qū)有大量炎細(xì)胞浸潤。

3 討論

CCl4誘導(dǎo)制備慢性肝損傷動物模型是一種經(jīng)典的造模方法，其造模途徑多樣，病理特征穩(wěn)定，已廣泛用于研究慢性肝損傷、肝纖維化發(fā)生的細(xì)胞及分子機(jī)制、血清學(xué)標(biāo)志物與組織病理的相關(guān)性及抗慢性肝損傷的藥效評價［2］。故本實(shí)驗(yàn)采用50%CCl4橄欖油溶液灌胃制備慢性肝損傷以觀察LW的藥效及其可能機(jī)制。

大鼠通過連續(xù)5周的50%CCl4橄欖油溶液灌胃中毒，經(jīng)肝組織病理學(xué)鏡檢觀察證實(shí)，不僅造成慢性肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷，而且肝組織間已有早期肝纖維化的形成，基本符合臨床慢性乙型肝炎的病理變化特征。慢性肝損傷的早期肝纖維化的形成因素有多種，主要是肝細(xì)胞外成分膠原蛋白等異常增生而降解不足的結(jié)果，也是多種慢性肝病發(fā)展為肝硬化必經(jīng)的病理過程。Hyp既是膠原蛋白形成的主要成分，也是判斷慢性肝損傷及其早期肝纖維化的重要指標(biāo)。從本實(shí)驗(yàn)的生化檢測和病理觀察結(jié)果分析，由于CCl4模型組動物肝內(nèi)Hyp的含量明顯增多，因而肝組織間膠原蛋白量增多，所以促使了早期肝纖維化的形成。當(dāng)給予LW干預(yù)后，高、中、低3個劑量組動物肝內(nèi)Hyp的含量均明顯低于CCl4模型組，并有明顯的劑量依賴性，表明LW對CCl4所致動物慢性肝損傷及其早期肝纖維化具有較好的防治作用。

表4 6組大鼠肝臟氧化和抗氧化指標(biāo)的比較Tab．4 The comparison of oxidation and antioxidant function of the rat in 6 groups ±s

表4 6組大鼠肝臟氧化和抗氧化指標(biāo)的比較Tab．4 The comparison of oxidation and antioxidant function of the rat in 6 groups ±s

與模型組比較，*1 P＜0.05，*2 P＜0.01;與正常組比較，*3 P ＜0.05，*4 P＜0.01Compared with themodel group，*1 P ＜0.01，*2 P ＜0.05;Compared with the normal group，*3 P ＜0.05，*4 P ＜0.01

組別 劑量/(g·kg-1)MDA/(nmol·mg-1)第1批(n=8)第2批(n=7)改變率/%SOD/(U·mg-1)第1批(n=8)第2批(n=7)改變率/%靈五高劑量組 7.00 1.26±0.36*1 0.99±0.12*2 30.9 552.89±80.30*1 136.28±11.78*1 19.3靈五中劑量組 3.50 1.42±0.33 1.02±0.12*2 25.7 524.52±71.05 134.34±7.25*1 15.3靈五低劑量組 1.75 1.52±0.39 1.08±0.05*2 20.7 484.51±58.56 126.68±6.61 7.6陽性對照組 0.81 1.69±0.59 1.07±0.15*2 16.8 550.89±48.08*1 134.63±8.58*1 18.3模型組 … 2.03±0.77*3 1.29±0.17*4 0.0 461.34±59.56*3 114.94±18.98*4 0.0正常組 … 1.37±0.31 0.97±0.03 … 552.69±67.63 153.06±21.16…

表5 6組大鼠肝脾腫大、胸腺萎縮比較Tab．5 The comparison of hepatosplenomegaly and thym ic atrophy of the rat in 6 groups %，±s

表5 6組大鼠肝脾腫大、胸腺萎縮比較Tab．5 The comparison of hepatosplenomegaly and thym ic atrophy of the rat in 6 groups %，±s

與模型組比較，*1 P＜0.01，*2 P＜0.05;與正常組比較，*3 P＜0.01Compared with themodel group，*1 P ＜0.01，*2 P ＜0.05;compared with the normal group，*3 P ＜0.01

組別 劑量/(g·kg-1)肝指數(shù)第1批(n=8) 第2批(n=7) 改變率脾指數(shù)第1批(n=8) 第2批(n=7) 改變率胸腺指數(shù)第1批(n=8) 第2批(n=7) 改變率靈五高劑量組 7.00 2.99±0.16 3.58±0.11*1 11.0 0.24±0.02*2 0.25±0.01 10.4 0.15±0.02 0.13±0.01*1 25.1靈五中劑量組 3.50 3.02±0.28 3.63±0.14*1 9.9 0.25±0.02 0.26±0.01 8.3 0.14±0.01 0.13±0.01*1 18.8靈五低劑量組 1.75 3.06±0.16 3.65±0.15*1 9.0 0.27±0.04 0.26±0.02 3.8 0.13±0.01 0.12±0.01*2 13.2陽性對照組 0.81 3.02±0.11 3.62±0.44*1 10.1 0.26±0.01 0.26±0.01 4.2 0.15±0.03 0.12±0.01*2 20.0模型組 … 3.07±0.20*3 4.44±0.27*3 0.0 0.28±0.03*3 0.27±0.06*3 0.0 0.13±0.01 0.10±0.01*3 0.0正常組 … 2.57±0.13 2.98±0.05 … 0.21±0.01 0.21±0.01 … 0.16±0.03 0.13±0.02…

CCl4所致大鼠慢性肝損傷重要指標(biāo)是血清ALT、AST、ALP酶活性的明顯升高，ALB、TP含量的明顯降低和肝病理學(xué)的變化［3-4］。本實(shí)驗(yàn)CCl4模型組大鼠血清ALT、AST、ALP酶活性均顯著升高，ALB、TP含量明顯降低，肝組織病理明顯改變和肝脾指數(shù)升高，胸腺指數(shù)降低，表明造模成功。經(jīng)給予LW干預(yù)后，高、中、低3個劑量組動物血清中ALT、AST、ALP酶活性均顯著降低，ALB、TP含量明顯升高，肝組織病理明顯改善，肝脾指數(shù)降低，胸腺指數(shù)增加，表明LW對CCl4所致動物慢性肝損傷具有明顯的保肝降酶作用。

當(dāng)CCl4進(jìn)入肝臟，激活肝臟細(xì)胞色素P450，繼而生成CCl3，即三氯甲基自由基，攻擊肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的磷脂分子，引起膜的脂質(zhì)過氧化，引起膜結(jié)構(gòu)和功能完整性的破壞［5-6］。隨著中毒次數(shù)與時間的增加和延長，慢性肝損傷及其早期肝纖維化就會越來越明顯。SOD是機(jī)體防御氧自由基損傷和破壞的一種重要金屬酶［7-8］，可使自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，阻止 CCl4分解為CCl3自由基團(tuán)，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。本研究結(jié)果顯示，LW可顯著增加受損機(jī)體SOD活力，從而增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，加速自由基的清除，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，抑制過氧化產(chǎn)物MDA產(chǎn)生及清除過量的MDA，從而保護(hù)肝臟的結(jié)構(gòu)和功能。

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