吳利云，羅冬嬌，童夏生，阮正英，王恩智，陳豪

(1.浙江省臺州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院澤國院區(qū)，317523;2.杭州師范大學(xué)錢江學(xué)院，310012)

缺血-再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)是指細胞因缺血發(fā)生可逆性、可存活的損傷，在缺血糾正后這種損傷反而加重并引起細胞死亡或進一步的功能障礙。細胞凋亡是心肌IRI發(fā)生的重要機制之一，是心肌受損、心力衰竭發(fā)展的重要因素。體外實驗證明腺病毒過度表達激活的RhoA作用于Rho激酶可導(dǎo)致心肌細胞肥大，繼而促發(fā)細胞凋亡［1］。筆者研究心肌IRI大鼠模型，探討Rho激酶在缺血-再灌注心肌細胞中是否有促凋亡作用，以及葛根素(Puerarin)對Rho激酶水平的影響，從而為心肌IRI的治療及中藥在臨床使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠45只，購于溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，動物證號:SCXR(浙)2005-0019，清潔級，體質(zhì)量250～350 g，7～10周齡。飼養(yǎng)于恒溫、凈化、通風(fēng)動物房，自由進食和飲水，室溫保持(25±2)℃。

1.2 試劑 葛根素注射液(浙江康恩貝制藥股份有限公司產(chǎn)品，批號:060102)，細胞凋亡檢測試劑盒和TUNEL試劑盒(購于晶美生物工程有限公司)。兔抗P2MYPT1(Thr850)抗體(Upstate公司)，兔抗β-actin抗體(Santa cruz公司)，辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物公司)，ECL試劑(Santa cruz公司)。流式細胞儀(FACS Calibur，Becton Dickinson公司)。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與給藥 45只SD大鼠隨機分為3組:空白對照組、模型對照組和藥物治療組，每組15只。術(shù)前12 h禁食不禁水?？瞻讓φ战M曠置左冠狀動脈前降支30 min;而模型對照組和藥物治療組用血管夾夾閉左冠狀動脈前降支30 min，再灌注2 h?？瞻讓φ战M和模型對照組于術(shù)前30 min分別經(jīng)股靜脈輸注0.9%氯化鈉溶液2 mL·(100 g)-1，而藥物治療組于術(shù)前30 min經(jīng)股靜脈注射葛根素注射液0.05 g。術(shù)畢處死，取心尖以上缺血梗死區(qū)橫切3 mm厚心肌組織，去離子水漂洗3次，用現(xiàn)配多聚甲醛液固定。

1.3.2 動物模型的制作 采用改進方法造模再灌注，造模方法參照文獻［2］:大鼠用戊巴比妥鈉麻醉后，氣管切開接動物呼吸機，呼吸頻率60次·min-1，潮氣量2 mL·(100 g)-1。用止血鉗游離大鼠左側(cè)的胸大肌，暴露左第2，3，4 肋，分別在左第2，3，4肋間隙距離胸骨左緣約0.5 cm處進針穿線，每個肋間隙同一進針點穿兩根0號手術(shù)線約40 cm，再將兩根線用力拉向兩側(cè)，分開肋間肌和軟組織并結(jié)扎肋間動脈，留取結(jié)扎線的剩余部分，將兩根結(jié)扎線剩余部分用力拉向兩側(cè)拉開胸腔，并固定之。充分暴露心臟及其表面的血管，剪開心包膜，結(jié)扎冠狀動脈前降支，結(jié)扎之前在預(yù)結(jié)扎的冠狀動脈前降支處放置一根長約0.5 cm直徑1.5 mm的乳膠管，打一個活結(jié)結(jié)扎，以備進行反復(fù)多次IRI實驗。灌脈結(jié)扎成功標(biāo)志:結(jié)扎線遠端心肌顏色發(fā)紺，心電圖Ⅱ?qū)?lián)上ST段弓背上抬0.1 mV和(或)T波高聳為完全結(jié)扎標(biāo)志。再灌注損傷模型成功標(biāo)志:缺血部位心肌顏色恢復(fù)，抬高的S-T段下降＞50%。

1.3.3 指標(biāo)測定 ①電鏡觀察組織超微改變:取心尖以上缺血梗死區(qū)橫切心肌厚3 mm，2.5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，環(huán)氧樹脂包埋切片，鉛/鈾染色。

1.3.4 TUNEL法檢測細胞凋亡 取各組心肌組織，用4%甲醛固定，石蠟包埋，切片，采用TUNEL法檢測心肌細胞凋亡。具體步驟按試劑盒要求進行。以不加TUNEL反應(yīng)混合物作陰性對照。結(jié)果的判定以背景無顏色、細胞核內(nèi)著棕黃色顆粒為陽性細胞。凋亡指數(shù)按文獻［3］計算。

1.3.5 流式細胞儀檢測 0.25%胰蛋白酶消化細胞，1 000 r·min-1(離心機半徑10 cm)離心5min去除培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution，PBS)洗滌1次，棄上清液，收集細胞。PBS 100μL重懸細胞，分別加入Annexin VFITC試劑5μL和20μg·μL-1碘化丙啶(propidium iodide，PI)溶液10μL，室溫中避光孵育15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.3.6 細胞內(nèi)鈣離子(Ca2+)濃度測定 采用原子吸收分光光度法測定。

1.3.7 Western blot法檢測Rho激酶蛋白表達 每瓶細胞加入放射免疫沉淀測定(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液和苯甲基碘酰氟(phenylmethyl sulfonyl fluoride，PMSF)1 mL，冰上裂解60 min，再將裂解細胞吸入1.5 mL Ep管，12 000 r·min-1(離心肌半徑10 cm)離心15 min(4℃)，留取上清液?？捡R斯亮藍法測定蛋白濃度。按每孔蛋白20μg上樣行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，用轉(zhuǎn)移緩沖液把凝集上蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝化纖維素(nitrocellulose，NC)膜上(Pall公司)，麗春紅染色檢測蛋白轉(zhuǎn)印是否完全，膜在室溫下用50 g·L-1脫脂奶奶粉封閉液封閉1 h，加入兔抗磷酸化下游底物1(myosin phosphatase target subunit1，PMYPT1)(Thr850，1∶1 500)抗體，4 ℃孵育12 h。洗膜3次，每次5 min。辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶1 000)室溫孵育1 h，洗膜3次，每次5 min，加入電致化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)發(fā)光液顯色曝光1～2 min，用化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測雜交信號，以β-actin作內(nèi)參，用數(shù)碼成像分析系統(tǒng)軟件對Western blot結(jié)果進行定量分析，吸光度值表示蛋白相對表達量。

1.3.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，所得計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 透射電鏡觀察結(jié)果 空白對照組:心肌細胞無水腫，肌小節(jié)明暗帶清晰，線粒體無腫脹，嵴突規(guī)則致密，核膜完整無皺縮，染色質(zhì)疏松、密度均一;模型對照組:心肌細胞明顯水腫，線粒體腫脹，嵴明顯減少或消失，肌絲斷裂;肌小節(jié)明暗帶模糊不清，肌絲斷裂溶解，部分細胞核染色質(zhì)凝集成塊呈凋亡改變，偶見凋亡小體;藥物治療組:線粒體包膜完整、嵴密集。肌小節(jié)等長，各帶清晰;核膜完整輕度皺縮，染色質(zhì)濃縮趨邊、呈點狀分布。凋亡細胞明顯減少。

2.2 細胞內(nèi)Ca2+濃度的檢測結(jié)果 心肌細胞IRI后胞內(nèi)Ca2+濃度明顯高于空白對照組，藥物治療組胞內(nèi)Ca2+濃度比模型對照組顯著降低(P＜0.01)，見表1。

2.3 心肌細胞凋亡指數(shù)的檢測結(jié)果 心肌細胞缺血-再灌注后TUNEL染色檢測到大量的凋亡細胞(光鏡下觀心肌細胞核內(nèi)出現(xiàn)不同程度的黃褐色染色即判斷為凋亡細胞)，其凋亡指數(shù)顯著高于正常對照組(P＜0.01);藥物治療組胞核著色明顯減弱，凋亡指數(shù)顯著低于模型對照組(P＜0.01)(表1)。模型對照組凋亡指數(shù)明顯高于空白對照組和藥物治療組(P＜0.01)，但藥物治療組凋亡指數(shù)高于空白對照組(P＜0.05)。TUNEL標(biāo)記陽性的細胞核被染成棕褐色，細胞質(zhì)復(fù)染為淡藍色。

2.4 心肌細胞凋亡率的影響 心肌細胞缺血-再灌注后流式細胞儀記錄到典型的凋亡峰，其凋亡率顯著高于空白對照組(P＜0.01);藥物治療組凋亡率明顯下降，與模型對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)(表1)。

表1 3組大鼠心肌細胞Ca2+濃度、凋亡率和凋亡指數(shù)的檢測值±s

表1 3組大鼠心肌細胞Ca2+濃度、凋亡率和凋亡指數(shù)的檢測值±s

與模型對照組比較，*1 P＜0.01;與空白對照組比較，*2 P＜0.05，*3 P ＜0.01

組別Ca2+濃度/(μg·mg-1) 凋亡指數(shù) 凋亡率/%藥物治療組 133.72±5.48*1 15.16±1.53*1*2 38.28±1.84*1模型對照組 208.34±6.37 21.32±2.23*3 45.43±4.59*3空白對照組62.55±4.76 3.26±0.68 10.14±1.07

2.5 Western blot檢測Rho激酶蛋白表達 Rho激酶蛋白表達通過檢測其下游底物PMYPT1水平。Rho激酶蛋白相對表達量以Rho激酶蛋白與β-actin Western blot電泳條帶灰度比值表示?？瞻讓φ战M無Rho激酶激活，模型對照組、藥物治療組均有Rho激酶激活。Rho激酶蛋白相對表達量，設(shè)對照組為100%，模型對照組、藥物治療組為正常對照組的倍數(shù)。模型對照組PMYPT1水平是空白對照組的6.26倍(P＜0.01)，說明Rho激酶在心肌細胞IRI后有明顯的激活。藥物治療組用葛根素干預(yù)后，PMYPT1水平較模型對照組降低27.9%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，提示藥物治療組對Rho激酶有抑制作用。

3 討論

凋亡是指細胞由基因控制的主動性死亡過程。RhoA與細胞凋亡有密切關(guān)系，PIP3直接激活蛋白激酶B(protein kinase B，PKB，又稱 Akt)，而后者通過糖原合成激酶3、果糖磷酸激酶及一個引導(dǎo)潛在的生存信號而調(diào)節(jié)細胞生存。G蛋白的活性突變成員之一GI3通過依賴于RhoA途徑引起細胞死亡。Pur可以使細胞內(nèi)K+/Na+值升高，抑制細胞內(nèi)Ca2+的積聚，減少缺血-再灌注時心肌細胞的凋亡，從而心肌細胞生存率增加，具有良好的心肌保護作用［4］。葛根素干預(yù)可有效的降低胞內(nèi)Ca2+濃度，減輕自由基導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化損傷，達到抗心肌細胞凋亡的作用［5］。

本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)心肌細胞遭遇缺血-再灌注時胞內(nèi)明顯Ca2+超載，TUNEL染色檢測到大量的凋亡細胞，流式細胞儀紀(jì)錄到典型的凋亡峰，細胞凋亡指數(shù)和凋亡百分率顯著高于正常對照組，同時透射電鏡觀察到典型的凋亡超微結(jié)構(gòu):核固縮、邊集、并出現(xiàn)凋亡小體。提示細胞凋亡明確存在于心肌缺血-再灌注損傷的演變過程中，且與胞內(nèi)Ca2+超載有密切關(guān)系。而藥物治療組肌原纖維排列整齊，肌節(jié)清晰。線粒體膜基本完整，線粒體排列整齊。核膜完整輕度皺縮，染色質(zhì)濃縮趨邊、呈點狀分布。凋亡細胞明顯減少。胞內(nèi)Ca2+濃度比模型對照組顯著降低(P＜0.01)，凋亡率、凋亡指數(shù)均顯著低于模型對照組(P＜0.01)。Pur注射液對心肌缺血-再灌注損傷有保護作用。

RhoA屬小分子G蛋白家族，主要通過其下游效應(yīng)分子Rho激酶ROCK發(fā)揮作用。Rho激酶屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶，是Rho的主要效應(yīng)底物，有兩種異構(gòu)體:ROCK2Ⅰ和 ROCK2Ⅱ［6］。激活狀態(tài)的 RhoA與ROCK結(jié)合，ROCK進一步PMYPT1，從而調(diào)節(jié)細胞的多種行為，包括細胞形狀改變、遷移、基因轉(zhuǎn)錄、細胞周期調(diào)控等［7］。Rho/Rho激酶通路的主要病理作用是滅活肌球蛋白輕鏈磷酸酶導(dǎo)致血管痙攣，并可促進炎性因子分泌，參與炎性因子損害過程，促進細胞凋亡;在神經(jīng)系統(tǒng)，Rho激酶在缺血性神經(jīng)損傷病理過程中起重要作用，并可抑制神經(jīng)再生，使神經(jīng)突觸崩解［7］。③Rho激酶抑制藥具有神經(jīng)保護及抗凋亡作用［8-9］。本實驗提示模型對照組PMYPT1水平是正常組的6.26倍，說明Rho激酶在心肌細胞缺血-再灌注后有明顯的激活。用葛根素干預(yù)后，PMYPT1水平較模型對照組降低，提示葛根素對Rho激酶有抑制作用。以上結(jié)果說明葛根素可調(diào)節(jié)缺血-再灌注心肌細胞時Rho激酶的水平，進而提示Rho激酶與缺血-再灌注心肌細胞凋亡的發(fā)生密切相關(guān)。在本研究中，RHO激酶的活性通過其特異性下游底物MYPT1的磷酸化程度來檢測。本研究結(jié)果顯示，Rho激酶水平較正常組明顯上調(diào)，說明心肌細胞缺血-再灌注后有明顯Rho激酶的激活。用葛根素干預(yù)后，缺血-再灌注后Rho激酶水平較缺血-再灌注組明顯降低。

綜上所述，心肌細胞凋亡明確存在于缺血-再灌注損傷的過程中，Rho激酶導(dǎo)致缺血-再灌注細胞凋亡增加，葛根素可減少缺血-再灌注心肌細胞的凋亡，但其明確機制國內(nèi)外尚未有研究。本研究表明它對Rho激酶、凋亡基因的調(diào)控作用至少部分參與了對再灌注損傷的影響，這為臨床治療相關(guān)疾病提供了新的思路。有望成為治療缺血-再灌注損傷的有效藥物。

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