吳利云，羅冬嬌，童夏生，阮正英，王恩智，陳豪

(1.浙江省臺州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院澤國院區(qū)，317523;2.杭州師范大學(xué)錢江學(xué)院，310012)

缺血-再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)是指細(xì)胞因缺血發(fā)生可逆性、可存活的損傷，在缺血糾正后這種損傷反而加重并引起細(xì)胞死亡或進(jìn)一步的功能障礙。細(xì)胞凋亡是心肌IRI發(fā)生的重要機(jī)制之一，是心肌受損、心力衰竭發(fā)展的重要因素。體外實驗證明腺病毒過度表達(dá)激活的RhoA作用于Rho激酶可導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大，繼而促發(fā)細(xì)胞凋亡［1］。筆者研究心肌IRI大鼠模型，探討Rho激酶在缺血-再灌注心肌細(xì)胞中是否有促凋亡作用，以及葛根素(Puerarin)對Rho激酶水平的影響，從而為心肌IRI的治療及中藥在臨床使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠45只，購于溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，動物證號:SCXR(浙)2005-0019，清潔級，體質(zhì)量250～350 g，7～10周齡。飼養(yǎng)于恒溫、凈化、通風(fēng)動物房，自由進(jìn)食和飲水，室溫保持(25±2)℃。

1.2 試劑 葛根素注射液(浙江康恩貝制藥股份有限公司產(chǎn)品，批號:060102)，細(xì)胞凋亡檢測試劑盒和TUNEL試劑盒(購于晶美生物工程有限公司)。兔抗P2MYPT1(Thr850)抗體(Upstate公司)，兔抗β-actin抗體(Santa cruz公司)，辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物公司)，ECL試劑(Santa cruz公司)。流式細(xì)胞儀(FACS Calibur，Becton Dickinson公司)。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與給藥 45只SD大鼠隨機(jī)分為3組:空白對照組、模型對照組和藥物治療組，每組15只。術(shù)前12 h禁食不禁水?？瞻讓φ战M曠置左冠狀動脈前降支30 min;而模型對照組和藥物治療組用血管夾夾閉左冠狀動脈前降支30 min，再灌注2 h?？瞻讓φ战M和模型對照組于術(shù)前30 min分別經(jīng)股靜脈輸注0.9%氯化鈉溶液2 mL·(100 g)-1，而藥物治療組于術(shù)前30 min經(jīng)股靜脈注射葛根素注射液0.05 g。術(shù)畢處死，取心尖以上缺血梗死區(qū)橫切3 mm厚心肌組織，去離子水漂洗3次，用現(xiàn)配多聚甲醛液固定。

1.3.2 動物模型的制作 采用改進(jìn)方法造模再灌注，造模方法參照文獻(xiàn)［2］:大鼠用戊巴比妥鈉麻醉后，氣管切開接動物呼吸機(jī)，呼吸頻率60次·min-1，潮氣量2 mL·(100 g)-1。用止血鉗游離大鼠左側(cè)的胸大肌，暴露左第2，3，4 肋，分別在左第2，3，4肋間隙距離胸骨左緣約0.5 cm處進(jìn)針穿線，每個肋間隙同一進(jìn)針點穿兩根0號手術(shù)線約40 cm，再將兩根線用力拉向兩側(cè)，分開肋間肌和軟組織并結(jié)扎肋間動脈，留取結(jié)扎線的剩余部分，將兩根結(jié)扎線剩余部分用力拉向兩側(cè)拉開胸腔，并固定之。充分暴露心臟及其表面的血管，剪開心包膜，結(jié)扎冠狀動脈前降支，結(jié)扎之前在預(yù)結(jié)扎的冠狀動脈前降支處放置一根長約0.5 cm直徑1.5 mm的乳膠管，打一個活結(jié)結(jié)扎，以備進(jìn)行反復(fù)多次IRI實驗。灌脈結(jié)扎成功標(biāo)志:結(jié)扎線遠(yuǎn)端心肌顏色發(fā)紺，心電圖Ⅱ?qū)?lián)上ST段弓背上抬0.1 mV和(或)T波高聳為完全結(jié)扎標(biāo)志。再灌注損傷模型成功標(biāo)志:缺血部位心肌顏色恢復(fù)，抬高的S-T段下降＞50%。

1.3.3 指標(biāo)測定 ①電鏡觀察組織超微改變:取心尖以上缺血梗死區(qū)橫切心肌厚3 mm，2.5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，環(huán)氧樹脂包埋切片，鉛/鈾染色。

1.3.4 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 取各組心肌組織，用4%甲醛固定，石蠟包埋，切片，采用TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡。具體步驟按試劑盒要求進(jìn)行。以不加TUNEL反應(yīng)混合物作陰性對照。結(jié)果的判定以背景無顏色、細(xì)胞核內(nèi)著棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。凋亡指數(shù)按文獻(xiàn)［3］計算。

1.3.5 流式細(xì)胞儀檢測 0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，1 000 r·min-1(離心機(jī)半徑10 cm)離心5min去除培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution，PBS)洗滌1次，棄上清液，收集細(xì)胞。PBS 100μL重懸細(xì)胞，分別加入Annexin VFITC試劑5μL和20μg·μL-1碘化丙啶(propidium iodide，PI)溶液10μL，室溫中避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.3.6 細(xì)胞內(nèi)鈣離子(Ca2+)濃度測定 采用原子吸收分光光度法測定。

1.3.7 Western blot法檢測Rho激酶蛋白表達(dá) 每瓶細(xì)胞加入放射免疫沉淀測定(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液和苯甲基碘酰氟(phenylmethyl sulfonyl fluoride，PMSF)1 mL，冰上裂解60 min，再將裂解細(xì)胞吸入1.5 mL Ep管，12 000 r·min-1(離心肌半徑10 cm)離心15 min(4℃)，留取上清液?？捡R斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度。按每孔蛋白20μg上樣行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，用轉(zhuǎn)移緩沖液把凝集上蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝化纖維素(nitrocellulose，NC)膜上(Pall公司)，麗春紅染色檢測蛋白轉(zhuǎn)印是否完全，膜在室溫下用50 g·L-1脫脂奶奶粉封閉液封閉1 h，加入兔抗磷酸化下游底物1(myosin phosphatase target subunit1，PMYPT1)(Thr850，1∶1 500)抗體，4 ℃孵育12 h。洗膜3次，每次5 min。辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶1 000)室溫孵育1 h，洗膜3次，每次5 min，加入電致化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)發(fā)光液顯色曝光1～2 min，用化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測雜交信號，以β-actin作內(nèi)參，用數(shù)碼成像分析系統(tǒng)軟件對Western blot結(jié)果進(jìn)行定量分析，吸光度值表示蛋白相對表達(dá)量。

1.3.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，所得計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 透射電鏡觀察結(jié)果 空白對照組:心肌細(xì)胞無水腫，肌小節(jié)明暗帶清晰，線粒體無腫脹，嵴突規(guī)則致密，核膜完整無皺縮，染色質(zhì)疏松、密度均一;模型對照組:心肌細(xì)胞明顯水腫，線粒體腫脹，嵴明顯減少或消失，肌絲斷裂;肌小節(jié)明暗帶模糊不清，肌絲斷裂溶解，部分細(xì)胞核染色質(zhì)凝集成塊呈凋亡改變，偶見凋亡小體;藥物治療組:線粒體包膜完整、嵴密集。肌小節(jié)等長，各帶清晰;核膜完整輕度皺縮，染色質(zhì)濃縮趨邊、呈點狀分布。凋亡細(xì)胞明顯減少。

2.2 細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的檢測結(jié)果 心肌細(xì)胞IRI后胞內(nèi)Ca2+濃度明顯高于空白對照組，藥物治療組胞內(nèi)Ca2+濃度比模型對照組顯著降低(P＜0.01)，見表1。

2.3 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)的檢測結(jié)果 心肌細(xì)胞缺血-再灌注后TUNEL染色檢測到大量的凋亡細(xì)胞(光鏡下觀心肌細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)不同程度的黃褐色染色即判斷為凋亡細(xì)胞)，其凋亡指數(shù)顯著高于正常對照組(P＜0.01);藥物治療組胞核著色明顯減弱，凋亡指數(shù)顯著低于模型對照組(P＜0.01)(表1)。模型對照組凋亡指數(shù)明顯高于空白對照組和藥物治療組(P＜0.01)，但藥物治療組凋亡指數(shù)高于空白對照組(P＜0.05)。TUNEL標(biāo)記陽性的細(xì)胞核被染成棕褐色，細(xì)胞質(zhì)復(fù)染為淡藍(lán)色。

2.4 心肌細(xì)胞凋亡率的影響 心肌細(xì)胞缺血-再灌注后流式細(xì)胞儀記錄到典型的凋亡峰，其凋亡率顯著高于空白對照組(P＜0.01);藥物治療組凋亡率明顯下降，與模型對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)(表1)。

表1 3組大鼠心肌細(xì)胞Ca2+濃度、凋亡率和凋亡指數(shù)的檢測值±s

表1 3組大鼠心肌細(xì)胞Ca2+濃度、凋亡率和凋亡指數(shù)的檢測值±s

與模型對照組比較，*1 P＜0.01;與空白對照組比較，*2 P＜0.05，*3 P ＜0.01

組別Ca2+濃度/(μg·mg-1) 凋亡指數(shù) 凋亡率/%藥物治療組 133.72±5.48*1 15.16±1.53*1*2 38.28±1.84*1模型對照組 208.34±6.37 21.32±2.23*3 45.43±4.59*3空白對照組62.55±4.76 3.26±0.68 10.14±1.07

2.5 Western blot檢測Rho激酶蛋白表達(dá) Rho激酶蛋白表達(dá)通過檢測其下游底物PMYPT1水平。Rho激酶蛋白相對表達(dá)量以Rho激酶蛋白與β-actin Western blot電泳條帶灰度比值表示?？瞻讓φ战M無Rho激酶激活，模型對照組、藥物治療組均有Rho激酶激活。Rho激酶蛋白相對表達(dá)量，設(shè)對照組為100%，模型對照組、藥物治療組為正常對照組的倍數(shù)。模型對照組PMYPT1水平是空白對照組的6.26倍(P＜0.01)，說明Rho激酶在心肌細(xì)胞IRI后有明顯的激活。藥物治療組用葛根素干預(yù)后，PMYPT1水平較模型對照組降低27.9%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，提示藥物治療組對Rho激酶有抑制作用。

3 討論

凋亡是指細(xì)胞由基因控制的主動性死亡過程。RhoA與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系，PIP3直接激活蛋白激酶B(protein kinase B，PKB，又稱 Akt)，而后者通過糖原合成激酶3、果糖磷酸激酶及一個引導(dǎo)潛在的生存信號而調(diào)節(jié)細(xì)胞生存。G蛋白的活性突變成員之一GI3通過依賴于RhoA途徑引起細(xì)胞死亡。Pur可以使細(xì)胞內(nèi)K+/Na+值升高，抑制細(xì)胞內(nèi)Ca2+的積聚，減少缺血-再灌注時心肌細(xì)胞的凋亡，從而心肌細(xì)胞生存率增加，具有良好的心肌保護(hù)作用［4］。葛根素干預(yù)可有效的降低胞內(nèi)Ca2+濃度，減輕自由基導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化損傷，達(dá)到抗心肌細(xì)胞凋亡的作用［5］。

本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)心肌細(xì)胞遭遇缺血-再灌注時胞內(nèi)明顯Ca2+超載，TUNEL染色檢測到大量的凋亡細(xì)胞，流式細(xì)胞儀紀(jì)錄到典型的凋亡峰，細(xì)胞凋亡指數(shù)和凋亡百分率顯著高于正常對照組，同時透射電鏡觀察到典型的凋亡超微結(jié)構(gòu):核固縮、邊集、并出現(xiàn)凋亡小體。提示細(xì)胞凋亡明確存在于心肌缺血-再灌注損傷的演變過程中，且與胞內(nèi)Ca2+超載有密切關(guān)系。而藥物治療組肌原纖維排列整齊，肌節(jié)清晰。線粒體膜基本完整，線粒體排列整齊。核膜完整輕度皺縮，染色質(zhì)濃縮趨邊、呈點狀分布。凋亡細(xì)胞明顯減少。胞內(nèi)Ca2+濃度比模型對照組顯著降低(P＜0.01)，凋亡率、凋亡指數(shù)均顯著低于模型對照組(P＜0.01)。Pur注射液對心肌缺血-再灌注損傷有保護(hù)作用。

RhoA屬小分子G蛋白家族，主要通過其下游效應(yīng)分子Rho激酶ROCK發(fā)揮作用。Rho激酶屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶，是Rho的主要效應(yīng)底物，有兩種異構(gòu)體:ROCK2Ⅰ和 ROCK2Ⅱ［6］。激活狀態(tài)的 RhoA與ROCK結(jié)合，ROCK進(jìn)一步PMYPT1，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種行為，包括細(xì)胞形狀改變、遷移、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期調(diào)控等［7］。Rho/Rho激酶通路的主要病理作用是滅活肌球蛋白輕鏈磷酸酶導(dǎo)致血管痙攣，并可促進(jìn)炎性因子分泌，參與炎性因子損害過程，促進(jìn)細(xì)胞凋亡;在神經(jīng)系統(tǒng)，Rho激酶在缺血性神經(jīng)損傷病理過程中起重要作用，并可抑制神經(jīng)再生，使神經(jīng)突觸崩解［7］。③Rho激酶抑制藥具有神經(jīng)保護(hù)及抗凋亡作用［8-9］。本實驗提示模型對照組PMYPT1水平是正常組的6.26倍，說明Rho激酶在心肌細(xì)胞缺血-再灌注后有明顯的激活。用葛根素干預(yù)后，PMYPT1水平較模型對照組降低，提示葛根素對Rho激酶有抑制作用。以上結(jié)果說明葛根素可調(diào)節(jié)缺血-再灌注心肌細(xì)胞時Rho激酶的水平，進(jìn)而提示Rho激酶與缺血-再灌注心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生密切相關(guān)。在本研究中，RHO激酶的活性通過其特異性下游底物MYPT1的磷酸化程度來檢測。本研究結(jié)果顯示，Rho激酶水平較正常組明顯上調(diào)，說明心肌細(xì)胞缺血-再灌注后有明顯Rho激酶的激活。用葛根素干預(yù)后，缺血-再灌注后Rho激酶水平較缺血-再灌注組明顯降低。

綜上所述，心肌細(xì)胞凋亡明確存在于缺血-再灌注損傷的過程中，Rho激酶導(dǎo)致缺血-再灌注細(xì)胞凋亡增加，葛根素可減少缺血-再灌注心肌細(xì)胞的凋亡，但其明確機(jī)制國內(nèi)外尚未有研究。本研究表明它對Rho激酶、凋亡基因的調(diào)控作用至少部分參與了對再灌注損傷的影響，這為臨床治療相關(guān)疾病提供了新的思路。有望成為治療缺血-再灌注損傷的有效藥物。

［1］ DEL RE D P，MIYAMOTO S，BROWN J H ，et al.RhoAPRhokinase upregulate Bax to activate a mitochondrial death path way and induce cardiomyocyte apoptosis［J］ .J Biol Chem，2007，282(11):8069-8078.

［2］ 齊志敏，王倩，張瑩，等.大鼠心肌缺血-再灌注損傷實驗?zāi)Ｐ脱芯浚跩］.中國臨床康復(fù)，2004，8(30):6620-6621.

［3］ WU Q，LIL G ，CAIY C.Effects of carvedilol at different dose on cardiacmyocyte apoptosis and apoptosis-associated gene during heart failure subsequent tomyocardial infarction in rats［J］.JClin(China)，2003，19(4):228-230.

［4］ 陳江斌，黃從新，李庚山，等.葛根素對再灌注損傷心肌細(xì)胞內(nèi)K+/Na+及Ca2+濃度的影響［J］.中國危重病急救醫(yī)學(xué)，1999，11(1):48-49.

［5］ 吳青，周祖玉，陶大昌.葛根素預(yù)處理對大鼠缺血-再灌注心肌細(xì)胞凋亡的影響［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2005，25(2):147-151.

［6］ RIDLEY A J.Rhofamily proteins:coordinating cell responses［J］.Trends Cell Biol，2001，11:471-477.

［7］ WET TSCHURECK N，OFFERMAMSS.Rho/Rho-kinasemediated signalingin physiology and pathophysiology［J］.JMol Med，2002，80:629-638.

［8］ SATOH S，TOSHIMA Y，IKEGAKI I，et al.Wide therapeutic time window for fasudil neuroprotection against ischemia-induced delayed neuronaldeath in gerbils［J］.Brain Res，2007，1128:175-180.

［9］ RILITAKE Y，KIMA H H，HUANG Z，et al.Inhibition of Rhokinase(ROCK)leads to increased cerebral blood flow and stroke protection［J］.Stroke，2005，36:2251-2257.