劉亞玲，方 翔，石 力，嚴(yán)慶文，馮文婷，張永華，趙春陽(yáng)，盧圣樓，劉 紅，2*

（1.海南師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，海南 ?？?571158；

2.熱帶藥用植物化學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571158）

益智油雪花膏對(duì)小鼠皮膚光老化的保護(hù)作用

劉亞玲1，方 翔1，石 力1，嚴(yán)慶文1，馮文婷1，張永華1，趙春陽(yáng)1，盧圣樓1，劉 紅1，2*

（1.海南師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，海南 ?？?571158；

2.熱帶藥用植物化學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571158）

討論了皮膚外用益智油對(duì)紫外線（UV）照射引起的小鼠光老化皮膚的影響.實(shí)驗(yàn)采用清潔級(jí)雌性昆明種小鼠28只，隨機(jī)分成4組：正常對(duì)照組（I組）、模型組（II組）、模型+外涂5%益智雪花膏組（III組）、模型+外涂雪花膏組（IV組），每組7只.模擬日光紫外線長(zhǎng)期照射,形成皮膚光老化小鼠模型.用組織切片HE染色，觀察皮膚結(jié)構(gòu)改變.以生化分析方法測(cè)定羥脯氨酸（HYP）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活力以及丙二醛（MDA）的含量.結(jié)果表明：與II組相比，III組和IV組的HYP含量、SOD活力明顯升高（P＜0.05），MDA含量明顯降低（P＜0.05）；與IV組相比，III組的HYP含量、SOD活力較高，MDA含量較低.顯微鏡觀察真皮層，III組和IV組均有不同程度的膠原纖維組織增生及多少不等的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，但I(xiàn)II組纖維細(xì)胞分化更為成熟，說(shuō)明細(xì)胞修復(fù)功能增強(qiáng).因此，益智油雪花膏對(duì)紫外線照射引起的小鼠皮膚光老化具有保護(hù)作用.

益智；雪花膏；皮膚光老化

近年來(lái)由于大氣臭氧層的破壞，輻射到地球表面的紫外線逐漸增多，由此引起的各種皮膚病明顯增多[1].皮膚老化包括兩個(gè)過(guò)程，內(nèi)在老化（intrinsic或chrondogic aging）和光老化（actinic aging或Pho?toaging）[2].前者主要受遺傳和代謝等因素的影響，可通過(guò)改善自身營(yíng)養(yǎng)代謝平衡等措施加以防護(hù)；后者則主要受長(zhǎng)期紫外線照射所致，只能通過(guò)避免陽(yáng)光照射和使用防曬藥物來(lái)預(yù)防，而在實(shí)際生活中后者是很難避免的[3].減少自由基的產(chǎn)生、清除老化代謝產(chǎn)物和提高抗氧化酶活性已成為目前延緩皮膚衰老的有效方法[4-6].在中草藥中尋找高效、無(wú)副作用的天然自由基清除劑的研究已日益成為醫(yī)藥學(xué)和日用化學(xué)品科學(xué)一個(gè)十分活躍的研究領(lǐng)域[7-8].

益智（Alpinia oxyphylla）系姜科山姜屬多年生草本植物，主要分布在海南澄邁、瓊中等地，為海南地道藥材之一，也是我國(guó)四大南藥之一，廣東和廣西等地區(qū)亦有栽培.益智仁為益智的干燥成熟果實(shí)，是益智入藥的主要部分,分為生品和鹽炙品.生品性溫味辛，主歸脾、腎經(jīng)，具有溫脾止瀉，攝唾涎，治療脾寒泄瀉、腹中冷痛、口多唾涎等疾病.鹽炙品可緩其辛燥，主入腎經(jīng)，以補(bǔ)腎縮尿澀精為主，治療腎虛遺尿、小便頻數(shù)、遺精白濁等疾病[9].現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，益智具有神經(jīng)保護(hù)、抗氧化、抗癌癥、強(qiáng)心和舒張血管等作用[10].本研究選擇清潔級(jí)雌性昆明種小鼠為研究對(duì)象，建立小鼠光老化動(dòng)物模型，以益智油雪花膏外用，通過(guò)HE染色觀察皮膚組織形態(tài)學(xué)改變，通過(guò)羥脯氨酸（HYP）、超氧化物歧化酶（SOD）以及丙二醛（MDA）的的測(cè)定分析皮膚膠原含量變化，觀察益智油雪花膏抗皮膚光老化的生物學(xué)效應(yīng).

1 材料和儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠，清潔級(jí)，雌性，體重28±2（g），購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào):省科學(xué)技術(shù)委員會(huì)2000A024，省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)管會(huì)26-2001A009.

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑盒

總抗氧化能力試劑盒、HYP試劑盒、SOD試劑盒和MDA試劑盒均購(gòu)買(mǎi)于南京建成生物工程研究所.

1.3 益智油的提取

參見(jiàn)文獻(xiàn)[11].

1.4 益智油雪花膏的制備[12]

分別稱量硬脂酸20.0 g、鯨蠟醇0.5 g、甘油8.0 g、三乙醇胺1.2 g、尼泊金異丙酯0.5 g以及5%的益智油適量于250 mL燒杯中，氫氧化鈉0.3 g、去離子水73 mL稱量后加入另一250 mL燒杯中.分別加熱至90℃，使物料熔化、溶解均勻.裝水相的燒杯在90℃下保持20 min滅菌，在攪拌下將水相慢慢加入到油相中，繼續(xù)攪拌，靜置、冷卻至室溫.

1.5 儀器

紫外線燈管（UVA，40 w，光譜集中在365 nm；UVB，36 w，光譜集中在297 nm，北京電光源研究所）；721可見(jiàn)光分光光度計(jì)（上海光學(xué)儀器五廠）；800型電動(dòng)離心機(jī)（金壇市富華儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；HPM-500B電子調(diào)溫電熱套（金壇市金南儀器制造有限公司）；TP-214型電子分析天平（丹佛儀器（北京）有限公司）.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組

小鼠28只，隨機(jī)分為4組，每組7只：正常對(duì)照組（I組）、模型組（Ⅱ組）、模型+外涂5%益智雪花膏組（Ⅲ組）、模型+外涂雪花膏組（IV組）.

2.2 小鼠光老化模型的建立及其給藥方法

參考國(guó)內(nèi)光老化動(dòng)物模型方法建立動(dòng)物模型[13-14].照射組動(dòng)物置于自制鼠盒、絲狀盒蓋固定,背部暴露.模擬日光照射儀在距光源50 cm處同時(shí)進(jìn)行UVA和UVB照射.每日1次，每次UVA的照射劑量為10 J/cm2；UVB為30 mJ/cm2，平均每次照射時(shí)間15 min，連續(xù)UV照射共20周.照射前用嬰兒剃毛器剃除小鼠背部的絨毛,脫毛范圍（2 cm×3 cm），脫毛區(qū)給藥（Ⅲ組益智雪花膏外用，IV組雪花膏外用，每次Ⅲ組、IV組雪花膏的量相同，照射前預(yù)防性涂抹2周）.實(shí)驗(yàn)期間每1-2 d對(duì)I、Ⅱ、Ⅲ、IV組小鼠進(jìn)行剃毛處理，使用專(zhuān)用刷子將藥物均勻涂布于小鼠的試驗(yàn)區(qū)域，照射期間若發(fā)現(xiàn)小鼠實(shí)驗(yàn)區(qū)域發(fā)紅潰爛，長(zhǎng)水泡等情況即停止照射2日.

2.3 皮膚組織切片的制作及HYP、SOD、MDA的測(cè)定[15]

20周后，眼眶采血用于測(cè)定HYP、SOD、MDA含量.然后處死全部小鼠，立即取下背部脫毛區(qū)全層皮膚，1/3皮膚用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%福爾馬林溶液浸泡48 h，石蠟包埋，切片，HE染色，樹(shù)脂封片.

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果與討論

3.1 實(shí)驗(yàn)期間小鼠狀況

實(shí)驗(yàn)期間小鼠狀況良好，進(jìn)食正常，體重變化見(jiàn)表1.初期由于剃毛的不適應(yīng)性，剃毛區(qū)域稍有紅腫，隨著剃毛次數(shù)增加，紅腫漸漸消失.照射8周半后，發(fā)現(xiàn)背部毛發(fā)生長(zhǎng)緩慢，遂將體毛周期改為每天剃毛一次.14周后部分實(shí)驗(yàn)小鼠背部裸露皮膚出現(xiàn)紅斑、水皰等現(xiàn)象，停照1-2 d后，該狀況消失.

表1 實(shí)驗(yàn)小鼠體重變化（±s，n=7)Tab.1The weight change of the experimental mice

表1 實(shí)驗(yàn)小鼠體重變化（±s，n=7)Tab.1The weight change of the experimental mice

組別 0周 2周 15周 20周Ⅰ組Ⅱ組Ⅲ組Ⅳ組19.26±0.65 20.46±0.56 20.62±1.23 19.82±0.85 28.35±1.62 27.23±1.07 28.06±1.50 28.31±0.98 32.17±1.67 31.80±2.0 32.34±0.56 31.23±1.09 35.21±3.52 34.23±1.20 34.02±2.62 34.52±2.17

3.2 益智油雪花膏對(duì)小鼠皮膚組織HYP、SOD、MDA的影響

由表2可知，Ⅱ組小鼠血液與Ⅰ組相比，SOD、HYP活性明顯下降，MDA含量增加.Ⅲ組小鼠血液SOD、HYP含量明顯高于Ⅱ組，MDA含量低于Ⅱ組.Ⅳ組SOD、HYP含量低于Ⅲ組，MDA含量高于Ⅱ組.Ⅲ組或Ⅳ組小鼠血液的T-AOC、SOD活力顯著高于Ⅰ組，MDA含量顯著低于Ⅰ組.

表2 益智提取物對(duì)小鼠血液HYP含量、SOD水平、MDA含量的影響（±s，n=7)Tab.2 Effects of different treatments on HYP、SOD and MDA in rats

表2 益智提取物對(duì)小鼠血液HYP含量、SOD水平、MDA含量的影響（±s，n=7)Tab.2 Effects of different treatments on HYP、SOD and MDA in rats

59.71±0.48 15.72±2.73 43.55±3.07 28.89±1.07Ⅰ組Ⅱ組Ⅲ組Ⅳ組2.95±0.95 1.03±0.84 2.14±0.79 1.52±0.42 3.17±0.28 5.89±0.85 3.89±0.37 4.25±0.87

3.3 對(duì)與抗光老化有關(guān)的細(xì)胞的影響

膠原纖維增生與膠原蛋白合成有關(guān)，皮膚成纖維細(xì)胞合成的蛋白質(zhì)主要是膠原.

Ⅰ組：復(fù)層鱗狀層次清晰，真皮內(nèi)膠原纖維分布均勻，細(xì)胞胞漿著色鮮艷，核漿比列無(wú)異常，核呈梭形，體積較小，染色細(xì)致.

Ⅱ組：真皮內(nèi)成纖維增生一般，纖維細(xì)胞分化成熟，胞漿不豐富，胞核呈梭形，但體積不大，染色細(xì)致，間有少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn).

Ⅲ組：復(fù)層鱗狀上皮真皮內(nèi)膠原纖維增生明顯，纖維細(xì)胞分化成熟，胞漿豐富，淡紅色，胞核呈梭形，較肥胖，染色質(zhì)細(xì)致，間有少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn).

Ⅳ組：真皮內(nèi)成纖維增生稍為明顯，細(xì)胞分化成熟，胞漿豐富，胞核呈梭形，染色細(xì)致，間有少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn).

圖1 Ⅰ組Fig.1Normal control

圖2 Ⅱ組Fig.2Photoaging mode

圖3 Ⅲ組Fig.3Model plus Miquel

圖4 Ⅳ組Fig.4Model plus cream

經(jīng)益智雪花膏涂抹及未經(jīng)涂抹紫外線照射的小白鼠真皮層均有不同程度的膠原纖維組織增生及多少不等的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維細(xì)胞分化成熟.

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立小鼠光老化模型，發(fā)現(xiàn)光老化組小鼠皮膚SOD活力降低，提示抗氧化能力下降，羥脯氨酸含量降低，說(shuō)明細(xì)胞的膠原含量減少，并且細(xì)胞氧化程度增加，MDA含量增加，說(shuō)明細(xì)胞氧化程度增加，纖維細(xì)胞增生，說(shuō)明膠原蛋白合成活躍.而在預(yù)先用5%益智雪花膏保護(hù)的細(xì)胞各種改變均受到了明顯的抑制，比用等量純雪花膏涂抹的細(xì)胞抑制作用更為明顯，結(jié)果顯示益智抗皮膚光老化具有一定作用，這也為益智在美容醫(yī)療界的應(yīng)用提供了新的借鑒與視野.

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Protective Effec of Topical Use of Miquel Oxyphylla Cream on Photoaging Skin in Mice

LIU Yaling1，F(xiàn)ANG Xiang1，SHI Li1，YAN Qingwen1，F(xiàn)ENG Wenting1，ZHANG Yonghua1，ZHAO Chunyang1，LU Shenglou1，LIU Hong1，2＊
（1.College of Chemistry and Chemical Engineering，Hainan Normal University，Haikou571158，China；
2.Key Laboratory of Tropical Medicinal Plant Chemistry of Ministry of Education，Haikou571158，China）

To investigate the influence of topical use of Miquel oxyphylla cream on the ultraviolet（UV）radiation in?duced photoaging skin in mice.Twenty-eight female mice were randomly divided into four group of normal control(group I),photoaging mode（groupⅡ）,model plus Miquel oxyphylla-5%cream（groupⅢ）and model plus cream（group IV）with 7 mice each.The mouse model of photoaging skin was established by long-term UV radiation.Histologi?cal sections stained with HE,and the structural changes in skin was observed.HYP,SOD,MDA in the murine skin were detected by biochemical method.The result showed that Compared with groupⅡ,HYP,SOD in groupⅢand group IV increased significantly（P＜0.05）,MDA decreased significantly（P＜0.05）.Compared with group IV,HYP,SOD in groupⅢwere higher than that of in group IV,the content of MDA was lower than that of in group IV.There were obvious fibro?blasts hyperplasia in groupⅢand group IV,but the fiber cell of groupⅢdifferentiated more mature.That indicates the repair function of groupⅢwas stronger than group IV.Miquel oxyphylla cream has a protective effect against photoaging.Key words:Miquel oxyphylla；cream；photoaging

TQ 65

A

1674-4942（2011）04-0425-04

2011-10-15

國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃（101165817）

*通訊作者

畢和平