何秀華 李東良 江軍 徐穎 范敬靜 陳娟 陳勝平

活體肝移植是近年來發(fā)展起來的一種治療終末期肝病的新技術(shù)，為解決供肝來源的短缺開拓了新的途徑。活體肝移植的關(guān)鍵性技術(shù)之一是使移植到受體的肝組織塊以及供體剩余的肝組織能盡快再生，以滿足機體代謝所需有效的肝體積。因此，促進部分肝移植肝再生的研究也就成了近年來器官移植領(lǐng)域一個新的研究熱點。骨髓間充質(zhì)干細胞（ mesenchymal stem cells,MSCs ），是中胚層分化而成的一種非造血成體干細胞，近年來發(fā)現(xiàn)其不僅具有強大的潛在自我更新能力，并且在特定條件下可以分化成脂肪細胞、成骨細胞和肝細胞等多種細胞，動物實驗亦表明 MSCs 可以修復(fù)損傷或基因突變的骨、軟骨和心肌等組織[1]。但 MSCs 促進肝再生的確切作用尚不十分明確。本研究建立肝大部切除大鼠模型，將體外培養(yǎng)的骨髓 MSCs 分別通過尾靜脈及門靜脈兩種途徑移植到肝臟，觀察其在肝臟的歸巢、定植及對肝再生的作用，為骨髓干細胞（ bone marrow stem cell,BMSCs ）治療肝病提供理論依據(jù)。

材料和方法

一、材料

清潔級 SD 大鼠共 36只，其中 10周齡（體重 180～220 g）31只，4周齡（體重 60～80 g）5只，均購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號SCXK（滬）2007-0005，飼養(yǎng)于南京軍區(qū)福州總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)中心 IVC 清潔級實驗動物飼養(yǎng)系統(tǒng)；DMEM/F12培養(yǎng)基及胰酶均購自美國 Gibico公司；胎牛血清購自奧地利 PAA 公司；倉鼠抗大鼠CD29-PE、小鼠抗大鼠CD45-PE、小鼠抗大鼠CD90.1-PE 均購自美國 BioLegend 公司；小鼠抗大鼠CD34-PE購自美國 Santa Cruz 公司；4',6-二脒基-2-苯基吲哚（ 4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI ）購自美國 Roche 公司。

二、大鼠骨髓 MSCs 的分離與培養(yǎng)

將體重 60～80 g SD 大鼠，用 10﹪ 水合氯醛按 0.3ml/100 g 劑量腹腔注射麻醉，置于75﹪酒精浸泡約 20min，頭部露于酒精液面以上，無菌條件下分離出大鼠的股骨和脛骨，用注射器沖出骨髓細胞后經(jīng) 4 號針頭吹打，制成單細胞懸液，用加 10﹪ 胎牛血清 DMEM/F12 重懸細胞，接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶，置于37℃，5﹪CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d 后首次換液，以后每2～3 d 換液 1次，7～10d 細胞生長融合，經(jīng) 0.25﹪ 胰酶消化，1:2傳代，其后一般3 d 傳代 1次，選取生長良好的 P3 代細胞進行下列實驗。

三、大鼠骨髓 MSCs 的鑒定

胰酶消化 P3 代細胞，PBS 洗滌 2次，分別加入 PE 標記 CD29、CD34、CD45 和CD90 單克隆熒光抗體，同型對照，室溫避光孵育，應(yīng)用流式細胞儀檢測 MSCs 的表面標志。

四、DAPI 標記 MSCs

取 P3 代 MSCs，待細胞 60﹪～70﹪ 融合時，培養(yǎng)液中加入終濃度為 1 μg/ml DAPI 溶液，孵育12h后用PBS洗滌至少 6次，去除未與細胞結(jié)合的 DAPI，在熒光顯微鏡下觀察細胞標記情況。

五、肝大部切除模型構(gòu)建

體重 180～220 g 的 SD 大鼠31只，乙醚持續(xù)吸入麻醉，仰臥位固定，于劍突下 0.5 cm 腹中線剪開約 6 cm 長切口，打開腹腔，從肝蒂處結(jié)扎并切除肝左葉、中葉約 70﹪ 肝體積。觀察創(chuàng)面無滲血后縫合關(guān)閉腹腔，24 h 未死亡，活力及飲食基本恢復(fù)正常的 30只肝大部切除大鼠用于實驗研究。

六、分組處理

(1) 肝切除組：9只，只行肝大部切除；(2) MSCs 尾靜脈移植組：11只，肝大部切除后24 h，乙醚適度麻醉大鼠，將1.5ml 約含1.5×106的 MSCs 懸液從大鼠尾靜脈緩慢注入；(3) MSCs 門靜脈移植組 ：10只，肝大部切除后，即將0.15ml 約含 1.5×106的 MSCs 懸液從大鼠門靜脈緩慢注入。

七、MSCs 歸巢情況觀察

取術(shù)后 9 d 肝組織制作冰凍切片，于熒光顯微鏡下肝組織中 DAPI 標記的細胞計數(shù)。

八、大鼠肝功能檢測

術(shù)后第 3 天，眼眶后靜脈采血 1～2ml，經(jīng)5000 r/min離心 3min 獲血清 0.5ml，全自動生化分析儀檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）和血漿白蛋白（albumin，ALB）。術(shù)后第 9 天采用10﹪水合氯醛 0.3ml/100 g 麻醉后，下腔靜脈采血 1～5ml 做 ALT、AST 和ALB 檢測。

九、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、MSCs 的分離培養(yǎng)

分離培養(yǎng)的細胞早期呈圓形，隨后逐漸伸展，呈成纖維細胞樣，并逐漸生長排列為漩渦狀（圖1）。

二、MSCs 表面標志物測定

流式細胞儀結(jié)果顯示細胞均一性較好，CD34、CD45 的陽性率分別為 0.32﹪、0.60﹪，CD29、CD90 的陽性率分別為 98.6﹪、99.5﹪，說明傳代貼壁生長的梭形細胞為 MSCs （圖 2）。

三、大鼠術(shù)后一般情況

大鼠于術(shù)后半天內(nèi)開始活動、進食和飲水。對照組 9只大鼠均存活。門靜脈移植組中 1只大鼠因門靜脈注射細胞后止血不徹底而死亡，成活 9只。尾靜脈移植組中有 2只大鼠于注射細胞后即出現(xiàn)呼吸困難、四肢無力而死亡，成活 9只。術(shù)后 9 d，對照組中 3只、門靜脈組和尾靜脈組中 1只出現(xiàn)腹部顯著膨隆，解剖發(fā)現(xiàn)腹腔大量清亮腹水。

圖1 大鼠骨髓MSCs

圖2 大鼠骨髓 MSCs 的表面標志物

四、MSCs 歸巢情況

MSCs移植術(shù)后第 9 天，熒光顯微鏡觀察肝組織中帶有藍色熒光的 DAPI 標記陽性的 MSCs細胞，尾靜脈移植組大鼠肝組織可見較少量的DAPI標記細胞；尾靜脈組（7.6±2.0）個細胞/100倍視野，門靜脈組（18.1±3.4）個細胞/100倍視野。兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。說明移植等量 MSCs，門靜脈移植組到肝臟定歸巢及定植的 MSCs 多于尾靜脈移植組（ 圖 3 ）。

五、大鼠肝功能變化

術(shù)后第 3 天檢測各組大鼠均出現(xiàn)不同程度的血清轉(zhuǎn)氨酶升高及 ALB 降低，各組之間相比均無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。術(shù)后第9天各組大鼠肝功能均有好轉(zhuǎn)， ALT 及 AST 3組之間無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），但兩個移植組與單純肝切除組比較ALB均有明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.259，P=0.006），尾靜脈移植組與門靜脈移植組兩移植組之間相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05，表 1）。

圖3 肝內(nèi)DAPI 標記的 MSCs 免疫熒光檢查(×100)

表1 術(shù)后不同時間各組肝功能比較（）

表1 術(shù)后不同時間各組肝功能比較（）

注：與對照組相比 aP < 0.05

組別 動物數(shù)（只）3 d 9 d ALT（U/L） AST（U/L） ALB（g/L） ALT（U/L） AST（U/L） ALB（g/L）對照組 9 095.22±30.08 251.56± 61.94 30.22± 3.83 073.56±20.30 190.78±128.55 29.22± 5.29尾靜脈移植組 11 105.56±40.84 284.89±174.78 24.22±11.94 053.22±21.91 136.44± 57.70 35.11± 3.52a門靜脈移植組 10 150.78±86.86 402.56±162.94 27.44± 2.07 73.56±19.07 167.78± 55.10 34.11± 2.62a F 值 2.516 2.883 1.536 2.822 1.046 6.259 P 值 0.099 0.073 0.233 0.057 0.365 0.006

討 論

BMSCs 是具有自我更新、高度增生和多向分化潛能的細胞群體。BMSCs 主要包括造血干細胞（hemopoietic stem cells,HSCs）和MSCs。骨髓MSCs是骨髓基質(zhì)中主要的干細胞，參與基質(zhì)微環(huán)境的組成和造血功能的調(diào)控，并且可以跨越胚層橫向分化為各種組織細胞[2-6]，包括向肝樣細胞分化，具備取材方便、體外培養(yǎng)技術(shù)成熟、以及自體移植潛能等優(yōu)點，可為組織損傷和疾病治療提供一種理想的“種子”細胞。因此成為近年來再生醫(yī)學(xué)和組織工程研究的熱點之一。

內(nèi)環(huán)境和肝臟本身微環(huán)境是促進骨髓 MSCs 向肝樣細胞轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素，分化的肝樣細胞能夠?qū)p傷的肝臟起到一定的修復(fù)作用。Arikura 等[7]將先天性白蛋白缺乏癥大鼠肝臟做70﹪切除后，立即通過門靜脈植入正常大鼠骨髓 MSCs，4周后在受體肝臟檢測到白蛋白陽性并表達白蛋白 mRNA 的肝細胞，血清中也檢測到白蛋白。Abdel Azizet 等[8]將雄性大鼠骨髓中 CD29+MSCs 通過尾靜脈移植入肝纖維化模型雌性大鼠體內(nèi)，研究結(jié)果提示MSCs在體內(nèi)可以分化為肝樣細胞，并通過減少膠原沉積來發(fā)揮其抗纖維化作用。這些研究為 MSCs 治療肝病提供了理論依據(jù)。但也有相反的研究報道，例如在 Cantz 等[9]的研究中沒有發(fā)現(xiàn)骨髓 MSCs 向肝細胞分化，并促進其再生作用。包括 MSCs 在內(nèi)的干細胞治療肝臟疾病還有許多問題需要研究和探討。

本實驗建立肝大部切除大鼠模型，通過尾靜脈和門靜脈兩種不同途徑輸注DAPI標記的MSCs，主要觀察DAPI陽性MSCs在肝臟的歸巢、定植和對肝功能恢復(fù)的影響。結(jié)果移植等量MSCs，門靜脈移植組到肝臟歸巢及定植的MSCs多于尾靜脈移植組，移植途徑對MSCs歸巢、定植到肝臟有一定影響；另外，移植組肝臟合成白蛋白功能恢復(fù)的較快，提示MSCs具有促進肝細胞再生的能力。但是，兩種移植途徑相比在肝功能改善方面并沒有顯示出明顯差異，其原因和機制值得進一步研究和探討，推測可能與觀察時間較短有一定關(guān)系，但也不排除MSCs只起到一個刺激肝細胞或肝卵圓細胞活化的作用，因此肝臟合成能力的改善與歸巢定植到肝臟的MSCs數(shù)量不一致。一般認為肝部分切除后的肝再生主要由肝細胞再生完成，只有在大部分肝細胞死亡或肝毒性物質(zhì)持續(xù)作用時，卵圓細胞才快速增殖，參與肝再生[10-11]。骨髓細胞向肝細胞轉(zhuǎn)化僅在嚴重急性肝損傷的情況下發(fā)生，如卵圓細胞死亡時，BMSCs或定居于骨髓的肝干細胞迅速發(fā)生遷移，在肝臟中增殖分化為肝細胞[12]。MSCs在肝大部切除術(shù)后是否也有促進肝再生的作用尚不明確，本研究結(jié)果提示骨髓MSCs具有促進肝大部切除大鼠肝再生的作用。這為活體部分肝移植術(shù)后迅速促進肝再生，防治小肝綜合征的發(fā)生提供了一條新的思路，值得進一步深入研究。

1 何秀華,李東良.骨髓干細胞治療肝病研究進展[J].國際消化病雜志,2010,30(3):129-131.

2 Hayase M,Kitada M,Wakao S,et al.Committed neural progenitor cells derived from genetically modified bone marrow stromal cells ameliorate deficits in a rat model of stroke[J].J Cereb Blood Flow Metab,2009,29(8):1409-1420.

3 Tokcaer-Keskin Z,Akar AR,Ayaloglu-Butun F,et al.Timing of induction of cardiomyocyte differentiation for in vitro cultured mesenchymal stem cells: a perspective for emergencies[J].Can J Physiol Pharmacol,2009,87(2):143-150.

4 Liu JW,Dunoyer-Geindre S,Serre-Beinier V,et al.Characterization of endothelial-like cells derived from human mesenchymal stem cells[J].J Thromb Haemost,2007,5(4):826-834.

5 Hu J,Feng K,Liu X,et al.Chondrogenic and osteogenic differentiations of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells on a nanofibrous scaffold with designed pore network[J].Biomaterials,2009,30(28):5061-5067.

6 Chivu M,Dima SO,Stancu CI,et al.In vitro hepatic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells under differential exposure to liver-specific factors[J].Transl Res,2009,154(3):122-132.

7 Arikura J,Inagaki M,Huiling X,et al.Colonizationof albumin-produsing hepatocytes derived from transplanted F344 rat bone marrow cells in the live of congenic Nagase’ s anabuminemic rats[J].J Hepatol,2004,41(2):215-221.

8 Abdel Aziz MT,Atta HM,Mahfouz S,et al.Therapeutic potential of bone marrow-derived mesenchymal stem cells on xperimental liverfibrosis[J].Clin Biochem,2007,40(12):893-899.

9 Cantz T,Sharma AD,Jochheim-Richter A,et al.Reevaluation of bone marrow-derived cells as a source for hepatocyte regeneration[J].Cell Transplant,2004,13(6):659-666.

10 Katoonizadeh A,Nevens F,Verslype C,et al.Liver regeneration in acute severe liver impairment: a clinicopathological correlation study[J].Liver Int,2006,26(10):1225-1233.

11 Kuhlmann WD,Peschke P.Hepatic progenitor cells,stem cells, and AFP expression in models of liver injury[J].Int J Exp Pathol,2006,87(5):343-359.

12 Kucia M,Ratajczak J,Reca R,et al.Tissue-specific muscle,neural and liver stem/progenitor cells reside in the bone marrow,respond to an SDF-1 gradient and are mobilized into peripheral blood during stress and tissue injury[J].Blood Cells Mol Dis,2004,32(1):52-57.