廖聯(lián)明 鄭友生 江敏 趙素萍

隨著人們生活水平的提高，心腦血管疾病成為城鄉(xiāng)居民死亡的第一殺手。根據(jù)衛(wèi)生部公布的《2010中國(guó)衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)年鑒》，我國(guó)城市每十萬(wàn)人中已經(jīng)有235人死于心腦血管疾病。急性心肌梗死是心血管疾病中的一個(gè)非常嚴(yán)重的類型，患者部分心肌因嚴(yán)重而持久的缺血發(fā)生局部壞死，從而導(dǎo)致心臟功能的嚴(yán)重?fù)p害。以往認(rèn)為心肌梗死是一個(gè)不可逆的損傷，無(wú)論什么方法均不能使心肌疤痕組織重新變成有收縮功能的心肌組織。此外對(duì)于終末期的心功能不全患者，心臟移植是挽救他們生命的唯一辦法。由于心臟來(lái)源的有限和其昂貴的費(fèi)用，只有少數(shù)患者有機(jī)會(huì)接受心臟移植治療。因此迫切需要建立其他有效的療法。

最近10年干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展使細(xì)胞治療在心臟病中的應(yīng)用達(dá)到了一個(gè)新的高潮。短短的幾年心肌梗死的骨髓源干細(xì)胞治療即從動(dòng)物試驗(yàn)過(guò)渡到了臨床[1-3]。但移植的骨髓源干細(xì)胞分化而成的心肌細(xì)胞和受者的心肌細(xì)胞的電生理特性不完全一樣，可能產(chǎn)生心率失常。近年的研究認(rèn)為，在心肌中存在心肌干細(xì)胞，在急性心肌梗死和慢性心衰患者的心肌可檢測(cè)到被激活的心肌干細(xì)胞[2-7]。由于心肌干細(xì)胞的激活程度不高，不能對(duì)受損的心肌進(jìn)行有效的修復(fù)，因此如何通過(guò)小分子藥物激活患者的心肌干細(xì)胞，讓他們充分增殖和分化，是心肌干細(xì)胞研究的重點(diǎn)之一。本研究采用免疫磁珠的方法分離Sca-1+心肌干細(xì)胞，并探索黃芪甲苷對(duì)其分化的影響。

材料和方法

一、試驗(yàn)動(dòng)物和試劑

6～12周齡的昆明種小鼠購(gòu)自福建醫(yī)科大學(xué)吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。黃芪甲苷購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。膠原酶購(gòu)自Sigma公司?？股锼乜贵w磁珠為德國(guó)Miltenyi Biotec公司產(chǎn)品。其他試劑購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，化學(xué)試劑為分析純。

二、Sca-1+心肌干細(xì)胞的分選

[8]報(bào)道的方法，將6～12周齡的C57BL/6小鼠心臟取出后以0.025﹪的膠原酶灌注，剪碎心肌，以0.1﹪的膠原酶37℃ 消化30min。這種消化過(guò)程對(duì)成熟的心肌細(xì)胞是致死性的。消化后的細(xì)胞過(guò)70 μm的篩網(wǎng)后以Sca-1抗體-生物素復(fù)合物標(biāo)記，再以抗生物素抗體磁珠分選2次。分選的細(xì)胞以DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。DMEM 培養(yǎng)基含10﹪小牛血清、100 U/ml 青霉素 G、100μg/ml鏈霉素、2mmol L-谷氨酰胺、25mmol HEPES、10 ng/ml EGF和10 ng/ml SCF。

三、心肌干細(xì)胞的分化誘導(dǎo)

按參考文獻(xiàn)[8]報(bào)道的方法，將心肌干細(xì)胞以5×103/ml的密度接種于放置有消毒蓋玻片的6孔板內(nèi)，制備細(xì)胞爬片。每孔加入2ml DMEM-M199 (4:1)培養(yǎng)基，內(nèi)含10﹪馬血清、5﹪FBS、青霉素 (100 U/ml)、鏈霉素 (100μg/ml) ；2mmol/L L-glutamine 和黃芪甲苷 ( 終末濃度為20和200mg/L)。對(duì)照組只加培養(yǎng)液。72h后吸出培養(yǎng)基，小心加入磷酸緩沖液輕輕沖洗2次后，再加入4﹪多聚甲醛/磷酸緩沖液室溫固定15～20min。參照EliVision Plus試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，檢測(cè)特異性心肌細(xì)胞標(biāo)志蛋白desmin、α-sarcomeric actin和C-TnT。顯色劑為二胺基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine,DAB），陽(yáng)性顯色為棕色，以未誘導(dǎo)細(xì)胞作對(duì)照。

結(jié) 果

一、心肌干細(xì)胞的分離

根據(jù)文獻(xiàn)[8]報(bào)道的方法進(jìn)行分選。心肌細(xì)胞分選前6.1﹪表達(dá)Sca-1。經(jīng)磁珠分選后的細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)的結(jié)果顯示93.2﹪表達(dá)Sca-1（圖1）。此外，細(xì)胞不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志CD34和白細(xì)胞標(biāo)志CD45。CD31也不表達(dá)。

二、心肌干細(xì)胞的分化潛能

終末濃度為 250mg/L的黃芪甲苷誘導(dǎo)4周的干細(xì)胞呈多邊形，有偽足，偽足可相互接觸。免疫組化染色顯示細(xì)胞表達(dá)desmin、α-sarcomeric actin和C-TnT。而未誘導(dǎo)的細(xì)胞和20mg/L的黃芪甲苷誘導(dǎo)的細(xì)胞desmin、α-sarcomeric actin和C-TnT 均為陰性。說(shuō)明黃芪甲苷有促進(jìn)心肌干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的潛能(圖2 )。

圖1 心肌干細(xì)胞的表型測(cè)定

圖2 黃芪甲甙對(duì)心肌干細(xì)胞分化的影響

討 論

在哺乳動(dòng)物的成長(zhǎng)過(guò)程中，心臟的擴(kuò)大既依賴于心肌細(xì)胞的增殖，同時(shí)伴隨細(xì)胞體積的增大。在成長(zhǎng)的初期主要依賴心肌細(xì)胞的增殖，然后逐步過(guò)渡到依賴于細(xì)胞體積的增大，在成年期以后一般認(rèn)為心肌細(xì)胞就不太增殖了。這種觀點(diǎn)的產(chǎn)生主要基于以下事實(shí)：一方面心臟損傷后其功能很難有明顯的恢復(fù)，也未觀察到心肌細(xì)胞的再生；另一方面，在成人原發(fā)性的心臟腫瘤幾乎沒(méi)有。

雖然這些事實(shí)表明心肌細(xì)胞幾乎沒(méi)有再生能力，但并不能排除心肌細(xì)胞有一定的再生能力。1977 年 Rumyantsev等[9]曾經(jīng)指出在成年哺乳動(dòng)物的心室肌存在有限的細(xì)胞可合成DNA，進(jìn)入細(xì)胞分裂周期。他還指出在心房及冷血?jiǎng)游锏男呐K，心肌細(xì)胞的分裂能力更大。Beltrami等[4-5]推測(cè)在慢性心臟衰竭的長(zhǎng)時(shí)間的負(fù)荷下，心肌細(xì)胞可能已經(jīng)在經(jīng)歷了有限的分裂后慢慢失去了再生能力。因此他們采用急性心肌梗死后的心臟進(jìn)行研究。在發(fā)作心臟病7～17 h后死亡的13例患者中，他們發(fā)現(xiàn)，受損傷部位的心肌細(xì)胞會(huì)在一定程度上重新分裂、增殖許多天，離損傷部位較遠(yuǎn)的少數(shù)心肌細(xì)胞同樣會(huì)分裂、增殖。這項(xiàng)研究成果更新了心肌不能再生的傳統(tǒng)觀點(diǎn)。他們將這13例患者的心臟與死于其他原因的另10例患者的心臟對(duì)照后發(fā)現(xiàn)：死于心臟病發(fā)作的13例患者的梗死心肌邊緣部位，細(xì)胞分裂是死于其他原因的10例患者的84倍；較遠(yuǎn)的心肌組織細(xì)胞分裂，前13例患者是后10例患者的28倍左右。

2003 年 Oh 等[6]進(jìn)行了心肌細(xì)胞的首次分離。他們首先將6～12周齡的 C57BL/6 小鼠心臟取出后以 0.025﹪ 的膠原酶灌注，以0.1﹪的膠原酶消化。消化后的細(xì)胞過(guò)采用磁珠法分離出的Sca-1+心肌。心肌干細(xì)胞在5-氮胞苷的作用下，細(xì)胞表達(dá)肌節(jié)α-肌動(dòng)蛋白和肌鈣蛋白 -I。

1995年Wakitani等[10]發(fā)現(xiàn)5-氮胞苷可以將骨髓間充質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)成為骨骼肌細(xì)胞。此后Konieczny和Emerson[11]發(fā)現(xiàn)5-氮胞苷也可誘導(dǎo)小鼠胚胎細(xì)胞系向心肌細(xì)胞分化，并證實(shí)這類細(xì)胞含有肌細(xì)胞源性決定族，在甲基化狀態(tài)呈現(xiàn)轉(zhuǎn)錄失活，而在5-氮胞苷作用下，即去甲基狀態(tài)下，肌細(xì)胞決定族轉(zhuǎn)錄激活，從而使該類細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞。5-氮胞苷的這種作用在誘導(dǎo)心肌干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化試驗(yàn)中也得到證實(shí)[6,8]。5-氮胞苷作為抗腫瘤藥物具有一定的毒副作用，因此有必要尋找更安全有效的誘導(dǎo)劑。

中藥在治療心肌梗死方面的作用已經(jīng)得到證實(shí)。本研究有理由相信中藥中的一些小分子化合物可能通過(guò)不同的途徑抑制細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)細(xì)胞的增殖，從而發(fā)揮中藥的療效。冼紹祥等[12]通過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)中藥單體黃芪甲苷可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化成心肌樣細(xì)胞。此外陳嘉等[13]報(bào)道丹酚酸B能誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化。根據(jù)他們的研究結(jié)果，本研究采用黃芪甲苷誘導(dǎo)心肌干細(xì)胞，也發(fā)現(xiàn)具有很好的誘導(dǎo)作用。

心肌干細(xì)胞的潛在應(yīng)用價(jià)值還未被完全開(kāi)發(fā)之前，有許多問(wèn)題需要回答，尤其是其分化為心肌細(xì)胞的機(jī)制。進(jìn)行中藥誘導(dǎo)心肌干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的探索，將為應(yīng)用中醫(yī)藥治療心肌梗死提供新的理論依據(jù)。此外中藥有可能與細(xì)胞移植的方法相結(jié)合治心肌梗死，有廣闊的應(yīng)用前景。

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