樊愛萍,劉衛(wèi),閔勇,李四麗
(紅河學(xué)院理學(xué)院化學(xué)系,云南 蒙自 661100)
枇杷葉中齊墩果酸的提取工藝
樊愛萍,劉衛(wèi)*,閔勇,李四麗
(紅河學(xué)院理學(xué)院化學(xué)系,云南 蒙自 661100)
以微波法進(jìn)行提取,采用最優(yōu)的薄層分離-比色顯色法測定齊墩果酸含量,確定出微波提取的最佳工藝為:乙醇濃度95%、提取功率為630 W、微波時間為70 s、料液比為1:20(g/mL)。微波法與傳統(tǒng)的熱回流法、冷浸取法進(jìn)行比較,得出微波法的提取率為84.8%,熱回流法的提取率為64.1%,冷浸法的提取率為61.3%,即微波法提取率明顯高于其他2種方法,且結(jié)果顯示微波法提取齊墩果酸有效可行。
枇杷葉;齊墩果酸;微波;提取
枇杷葉為薔薇科植物枇杷Eriobotryajaponica(Thunb Lindl)的干燥葉,現(xiàn)代藥學(xué)測驗,枇杷葉含有皂苷、苦杏仁苷、烏索酸、齊墩果酸、鞣質(zhì)、VB1、VC等化學(xué)成分[1-2],其中齊墩果酸是一種重要的成分,由于其廣泛的生物學(xué)活性,它具有非常高的藥用價值,如抗腫瘤、保肝作用和降血脂、血糖及抗艾滋病等作用外[1],還具有抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抑制血小板聚集和抗氧化等多種藥理作用[3]。由于齊墩果酸結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜,人工合成較困難,從天然產(chǎn)物中提取齊墩果酸是獲得齊墩果酸的主要途徑。從天然產(chǎn)物中提取的齊墩果酸對動物無明顯的毒、副作用,現(xiàn)在歐美國家現(xiàn)以將其加工成保健食品,或者作為天然抗氧化劑應(yīng)用到食品中[4],齊墩果酸具有很大的開發(fā)前景。
目前大部分研究人員對齊墩果酸的提取大都采用傳統(tǒng)熱回流法、索氏提取法、冷浸提取法[5]等方法,而用微波法進(jìn)行提取的研究鮮見報道。
1.1.1 原料
枇杷葉:采自云南蒙自枇杷基地。
1.1.2 主要實驗儀器設(shè)備和藥品
微波爐:德國進(jìn)口,SMC;離心機:常州國華電器有限公司;7200型分光光度計:尤尼柯-上海儀器有限公司;TU-1901雙光束紫外可見分光光度計;電熱干燥箱:9030(A)101(A)-0(S)南京沃環(huán);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:RE-52上海比朗;薄層G板;齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品:上海融禾醫(yī)藥科技有限公司;香草醛;冰醋酸;高氯酸;乙醇;濃硫酸;硅膠層析粉;氯仿;丙酮等。
1.2.1 齊墩果酸測定方法研究
薄層分離-比色顯色:取1mL供試樣,標(biāo)準(zhǔn)液1mL,分別點于同一硅膠板上,以氯仿-丙酮(4:1)為展開劑展開,取出,揮去溶劑,在對照品部位噴以10%硫酸乙醇溶液,于105℃烘箱中烘7 min~8 min至顯示紫紅色,刮取與對照品相同位置以及等面積的斑點置于離心試管中,同時刮取等面積空白硅膠作為試劑空白。先精確加入新制的5%的香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL,振搖溶解后加入高氯酸0.8 mL,用封口膠封閉,搖勻后置于70℃水浴中加熱15 min,然后流水冷卻,再加乙酸乙酯4 mL,搖勻,離心取上層清液在最大吸收波長處測定。
1.2.2 完全提取實驗
準(zhǔn)確稱量1.0000 g枇杷葉粉末于錐形瓶中,按料液比為1:20(g/mL),以95%乙醇在630 W功率下提取3次,再按1:10料液比95%乙醇提取2次,每次提取70 s,合并提取液,定容于100 mL容量瓶中,用薄層分離-比色顯色法測定吸光度。并根據(jù)以下公式計算提取率:
經(jīng)過實驗,用氯仿-丙酮(4:1)展開劑展開后,確定出齊墩果酸的比移值為 0.926、0.933、0.933、0.900,取其平均值為0.930,0.900值偏低的原因可能是點樣不均勻以及展開劑比例不夠精確引起的,故在以后試驗過程中取樣時按比移值0.930進(jìn)行取樣測定。
紫外分光光度計掃描齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液結(jié)果,如表1所示。
表1 紫外分光光度計掃描結(jié)果Table 1 Ultraviolet spectrophotometer scanning results
由所測吸光度值可知,在波長為538 nm時吸光度值最大,故選擇538 nm為檢測波長。
以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,經(jīng)計算得回歸方程為:A=0.1511C-0.17673,r=0.99638, 在 4 μg/mL~20 μg/mL 范圍內(nèi),線性關(guān)系良好,結(jié)果見圖1。
圖1 齊墩果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Oleanolic acid standard curve
有文獻(xiàn)報道[6]采用比色法測定木瓜中的齊墩果酸含量,但通過實驗,所得枇杷葉提取液顏色呈深綠色,即枇杷葉中的色素也大量溶出,對其溶液直接進(jìn)行顯色測定,使其測定結(jié)果偏高很多,所以直接用比色法測定并不適用于枇杷葉中齊墩果酸含量的測定。另外,有文獻(xiàn)報道[7]采用薄層分離-分光光度法測定威靈仙的齊墩果酸含量,但通過將枇杷葉提取液用薄層分離后,在比移值范圍內(nèi)取樣、洗脫,在洗脫過程中易造成洗脫不完全,增大測定誤差,使測定結(jié)果偏低,另外用洗脫劑洗脫一方面增加成本,另一方面也使工序更為復(fù)雜,增加測定以及計算難度。
實驗結(jié)果表明,采用薄層分離-比色顯色法能消除枇杷葉提取液中色素等雜質(zhì)的干擾,且跑版后,不需洗脫劑洗脫,而直接取樣顯色,一方面簡化操作、節(jié)省時間、降低成本,另一方面可減小操作誤差,提高齊墩果酸的顯色靈敏度,使測定結(jié)果更準(zhǔn)確、可靠。故本實驗選取該法為測定方法。
2.5.1 乙醇濃度對枇杷葉中齊墩果酸的影響
采用75%、80%、85%、90%、95%不同濃度的乙醇-水溶液為提取劑提取齊墩果酸,測定提取液的吸光度值,結(jié)果見圖2。
圖2 乙醇濃度對提取率的影響Fig.2 Effects of ethyl alcohol density on extraction rate
圖2表明,齊墩果酸的吸光度值隨乙醇濃度的增大而逐漸增大,但隨著乙醇濃度的增加,色素等雜質(zhì)的溶出也越多,對測定造成很大干擾,且隨著溶劑濃度的增加,其成本會隨之增加。由圖2可知在85%~95%乙醇濃度時,吸光度值趨于平緩,故從提取率及成本考慮,選取85%、90%、95%作為正交試驗濃度因素的3個水平。
2.5.2 提取功率對枇杷葉中齊墩果酸的影響
采用 350、420、490、560、630 W 不同微波功率提取齊墩果酸,測定提取液在的吸光度值,結(jié)果見圖3。
圖3 微波功率對提取率的影響Fig.3 Effects of microwave power on extraction rate
圖3表明,微波功率過低(320 W),齊墩果酸的提取會不完全,而微波功率過高(>560 W)時,使乙醇沸騰,使提取劑的量減少,且對齊墩果酸的結(jié)構(gòu)造成破壞,所以當(dāng)功率達(dá)560 W后,增加功率會使齊墩果酸的提取率下降。所以本試驗選取490、560、630 W作為正交試驗的微波功率因素的3個水平。
2.5.3 提取時間對枇杷葉中齊墩果酸的影響
采用 50、60、70、80、90 s不同提取時間提取齊墩果酸,測定提取液的吸光度值,結(jié)果見圖4。
圖4 微波輻射時間對提取率的影響Fig.4 Effects of microwave irradiation time on extraction rate
由圖4可以看出,吸光度值隨提取時間的增大而增大,在80 s時吸光度值達(dá)最大,之后隨提取時間的增加吸光度值反而降低,這可能是因為隨著時間的延長,微波提取溫度會隨之增加,長時間受熱會造成齊墩果酸分解,故本實驗選取70、80、90 s作為正交試驗的提取時間因素的3個水平。
2.5.4 料液比對枇杷葉中齊墩果酸的影響
采用 1:10、1:15、1:20、1:25、1:30(g/mL)不同料液比提取齊墩果酸,測定提取液在的吸光度值,結(jié)果見圖5。
圖5 微波處理液料比對提取率的影響Fig.5 Effects of microwave dealing solvent to material on extraction rate
由圖5得知,當(dāng)料液比低于1:10時枇杷葉粉末不能被完全浸泡,達(dá)不到提取效果,當(dāng)在1:20時吸光度值達(dá)到最大,隨著料液比的增加,吸光度值下降,可能是因為較高的料液比使得微波在一定能量下加熱更多的溶液,達(dá)不到提取溫度,所需時間延長,吸光度值下降,所以本實驗選取 1:15、1:20、1:25 作為正交試驗的料液比因素的3個水平。
通過單因素試驗,考察乙醇濃度、提取功率、提取時間、乙醇用量4個因素,按L9(34)安排正交試驗,見表 2、3。
表2 正交試驗因素水平表Table 2 Orthogonal design of separation
表3 正交試驗結(jié)果Table 3 Orthogonal design and results of separation
從表3中方差結(jié)果分析可以得出,4個單因素對齊墩果酸的影響大小順序為乙醇濃度>料液比>提取時間>提取功率,且枇杷葉中提取齊墩果酸的最佳提取條件為A3B3C1D2,即乙醇濃度為95%,提取功率為630 W,提取時間為 70 s,料液比為 1:20。
經(jīng)過實驗得到熱回流以及冷浸取中1 g枇杷葉提取得到的齊墩果酸的吸光度值,以及與微波法比較的結(jié)果見表4。
表4 對比實驗結(jié)果Table 4 The result of comparative experiments
從3種提取方法的比較結(jié)果得出,在提取時間、料液比及提取率上微波法明顯優(yōu)于其他2種方法。微波能有效節(jié)約提取時間以及很好的控制提取溫度,保護(hù)活性物質(zhì)的功能成分不被破壞,所以本實驗采用微波進(jìn)行提取,并通過單因素試驗以及正交試驗設(shè)計優(yōu)選出最佳提取工藝條件。
經(jīng)過5次提取后,枇杷葉中的齊墩果酸幾乎被完全提取,由公式(1)計算得到枇杷葉中齊墩果酸的含量為 901.208 μg/g。
通過對齊墩果酸測定方法研究以及微波提取單因素試驗和正交優(yōu)選微波提取工藝的試驗,得出以下結(jié)論:
1)經(jīng)過3種測定方法的研究比較得出,薄層分離-比色顯色法應(yīng)用于測定枇杷葉中的齊墩果酸,結(jié)果更可靠、更有針對性。
2)由單因素試驗以及正交試驗設(shè)計優(yōu)化得出微波提取枇杷葉中齊墩果酸的最佳工藝路線為:乙醇濃度95%、提取功率為630 W、微波時間為70 s、料液比為1:20。
3)經(jīng)實驗得出微波法的提取率為84.8%,熱回流法的提取率為64.1%,冷浸法的提取率為61.3%,且從3種提取方法的條件比較得知,微波法在提取時間、料液比上微波法明顯優(yōu)于其他兩種方法,能更大程度的節(jié)約時間,降低能耗以及成本,更適用于工業(yè)化生產(chǎn)工藝。
4)經(jīng)過實驗得出蒙自枇杷葉中齊墩果酸的含量為901.208 μg/g。
[1]林玉霖,林文津,林力強.枇杷葉的研究現(xiàn)狀與開發(fā)前景[J].中藥材,2006,29(10):1111-1114
[2]國家醫(yī)藥管理局中草藥情報中心站.植物藥有效成分手冊[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1986:800
[3]湯華成,張東杰,趙蕾.功能性食品因子齊墩果酸研究進(jìn)展[J].食品科技,2007(9):16-18
[4]Pan X J,Niu G G,Liu H Z.Comparison of microwave assisted extraction and conventional extraction techniques for the extraction ofanshinones from Salviae miltiorrhize bunge[J].Biochem Eng J,2002(12):71277
[5]唐麗琴,劉圣,李矗,等.高效液相色譜法測定枇杷葉提取物中齊墩果酸與熊果酸的含量[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2004,24(12):726-726
[6]董海麗,縱偉.薄層分離-分光光度法測定木瓜中的齊墩果酸[J].安徽農(nóng)業(yè)通報,2007(15):26-28
[7]熊慧林,鄭茂鑫.薄層掃描法測定威靈仙中齊墩果酸的含量[J].中國中藥雜志,2007,32(2):357-359
Study on Extraction of Oleanolic Acid from Eriobotrya Japonica
FAN Ai-ping,LIU Wei*,MIN Yong,LI Si-li
(School of Science Honghe University,Mengzi 661100,Yunnan,China)
Microwave extraction method,using the best thin-layer separation-Colorimetric Determination of Color oleanolic acid content,identify the optimum microwave extraction as follows:95%ethanol concentration,extraction power of 630 W,microwave time 70 s,solid-liquid ratio of 1:20.Microwave method and conventional thermal reflux method,the cold soak comparison emulated obtained by microwave method of extraction rate of 84.8%,heat reflux extraction rate was 64.1%,the cold soak method of extraction rate was 61.3%,or microwave extraction was significantly higher than the other two methods,and the results showed that microwave extraction of oleanolic acid to be effective.
eriobotrya japonica(Thumb.)Lindl;oleanolic acid;microwave;extraction
紅河學(xué)院碩士專項基金(XSS07011)
樊愛萍(1977—),女(漢),講師,碩士,主要從事天然產(chǎn)物開發(fā)研究。
*通信作者:劉衛(wèi),教授,主要從事有機化學(xué)及天然產(chǎn)物研究。
2010-08-09