譚萍，方玉梅，王毅紅，張春生

（貴州六盤水師范學(xué)院，貴州 六盤水 553004）

苦蕎麥多糖的抗氧化作用

譚萍，方玉梅，王毅紅，張春生

（貴州六盤水師范學(xué)院，貴州 六盤水 553004）

為進(jìn)一步開發(fā)利用苦蕎資源，研究苦蕎麥多糖的抗氧化性。通過鄰苯三酚自氧化法、水楊酸法比色法分別測定苦蕎麥多糖清除超氧陰離子自由基（O2-·）以及羥基自由基（·OH）的效果。結(jié)果表明不同濃度的苦蕎多糖能顯著地清除超氧陰離子自由基和羥基自由基，隨著苦蕎麥多糖濃度的升高其抗氧化性作用逐漸增強(qiáng)。

苦蕎麥；多糖；抗氧化；自由基

近年來大量醫(yī)學(xué)研究說明，人體的多種疾病和過早衰老，是由于體內(nèi)過多的氧自由基（游離基）將正常細(xì)胞氧化破壞造成?？寡趸瘎┠軌蛳@些氧自由基，阻緩氧化反應(yīng)，因而有良好的保健、防衰老和減少疾病的作用。盡管長生不老只是個(gè)夢想，但是減少疾病、延緩衰老是所有人的愿望。因此，對清除自由基的天然抗氧化劑研究，已受到普遍關(guān)注。抗氧化劑廣泛應(yīng)用于食品、藥品、保健品等行業(yè)，需求量逐年增加，其中天然抗氧化劑的應(yīng)用越來越廣泛。許多學(xué)者已經(jīng)從多種植物中提取了天然抗氧化劑，并證明許多植物中含有抗氧化效果很好的活性物質(zhì)[1-2]。

植物多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、降血糖、刺激造血等多種生物學(xué)功效,而且對機(jī)體幾乎沒有毒性,故對植物多糖生物學(xué)功效的研究愈來愈引起國內(nèi)外藥理學(xué)家、生物學(xué)家和化學(xué)家們的興趣,它已成為當(dāng)代生物學(xué)的熱門領(lǐng)域。

農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)及食品營養(yǎng)學(xué)等方面的研究結(jié)果顯示，苦蕎麥其營養(yǎng)價(jià)值居所有糧食作物之首，因而蕎麥研究備受各國重視。目前，大多數(shù)對蕎麥的研究均集中于次生代謝物質(zhì)（生物類黃酮）的含量上，對蕎麥多糖的研究鮮見報(bào)道。但是苦蕎麥中次生代謝物質(zhì)的含量畢竟較少，而多糖是初生物代謝產(chǎn)物，其含量較生物類黃酮要大得多，本文采用鄰苯三酚自氧化法、水楊酸法比色法對苦蕎麥多糖的超氧陰離子自由基（O2-·）以及羥基自由基（·OH）的清除能力進(jìn)行了初步探討，以期為苦蕎麥的進(jìn)一步研發(fā)和應(yīng)用提供相應(yīng)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

六苦2號（由貴州六盤水市農(nóng)科所提供）；無水葡萄糖、碳酸氫鈉、濃硫酸、苯酚、乙醇、鋁片、鄰苯三酚、FeSO4·7H2O、水楊酸、鹽酸、過氧化氫、無水乙醇、Tris、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醚等試劑均為市售國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

UV-9100紫外分光光度計(jì)：北京瑞利公司；sartoriusBS110S電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋、FW80型高速萬能粉碎機(jī)：天津泰斯特儀器有限公司。

1.3 苦蕎麥多糖樣品的制備[3-4]

1.3.1 苦蕎麥多糖的提取方法

苦蕎麥多糖的提?。簻?zhǔn)確稱取新鮮六苦2號蕎麥種子（65℃烘干至恒重）1 g，于燒瓶中加入100 mL蒸餾水，70℃水浴回流提取1 h，過濾，并用蒸餾水再重復(fù)提取1次，合并2次濾液并容至200 mL，得到苦蕎麥多糖提取液。

1.3.2 苦蕎麥多糖樣品濃度測定

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：稱取在105℃干燥至恒重的無水葡萄糖0.100 g，置100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。精確吸取上述溶液1.0 mL，置50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度。精確吸取上述溶液3.0 mL，置10 mL容量瓶中，加入5%苯酚1 mL，混勻，再加入濃硫酸7 mL并計(jì)時(shí)，加水至刻度，旋渦混合5 min，放置1 min，加水至刻度，混勻，室溫20 min，再加水至刻度，備用。精確量取0.500 mg/mL葡萄糖溶液0.0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL，分別置 50 mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，配成不同濃度的對照品系列溶液。于485 nm波長處測定吸光度A。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法，以濃度（C，μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光值（A，510 nm）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程：

苦蕎麥多糖樣品含量的測定步驟：吸取50 μL樣品于10 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋到刻度，精確吸取3 mL，置10 mL容量瓶中，加入5%苯酚1 mL，混勻，再加入濃硫酸7 mL并計(jì)時(shí)，旋渦混合5 min，放置1 min，混勻，室溫20 min，再加水至刻度。于485 nm波長處測定吸光度A。

1.4 苦蕎麥多糖對超氧陰離子自由基（O2-·）的抑制率[4]

1.4.1 鄰苯三酚自氧化速率的測定

取 5 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液（pH8.2），2 mL雙蒸水混勻后在25℃水浴中保溫20 min，取出后立即加入在25℃預(yù)熱過的3 mmol/L鄰苯三酚0.5 mL（以10 mmol/L HCl配制，空白管用10 mmol/L HCl代替鄰苯三酚HCl溶液），迅速搖勻后倒入比色杯，420 nm下每隔30 s測定吸光度值。

1.4.2 樣品活性測定

按照上述步驟在加入鄰苯三酚前先分別加入0.2 mL不同濃度的樣品液，蒸餾水減少。同樣以10 mmol/L HCl溶液配制空白管作為對照。測定吸光度，并計(jì)算抑制率。

多糖對超氧陰離子自由基（O2-·）抑制率/%＝（A0-A1）/A0×100

式中：A0為鄰苯三酚自氧化平均吸光度；A1為加入樣品液后鄰苯三酚自氧化平均吸光度。

1.5 苦蕎麥多糖對·OH的抑制率[5]

按照Smirnof（1989）的方法，利用H2O2與FeSO4混合產(chǎn)生·OH，在體系內(nèi)加入水楊酸捕捉·OH并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510 nm下有最大吸收。

反應(yīng)體系：于25 mL容量瓶中依次加入2 mmol/L FeSO45 mL，6 mmol/L H2O25 mL，6 mmol/L水楊酸-乙醇15 mL，于37℃水浴中保溫15 min取出，以超純水為參比，510 nm下測其吸光度（A0），然后加入1 mL被測定樣品，搖勻，水浴37℃水浴中保溫15 min后取出，以超純水為參比，510 nm下測其吸光度（Ax）。

考慮到色素本身的吸收光值，做對照實(shí)驗(yàn)：于25mL容量瓶中依次加入2 mmol/L FeSO45 mL，雙蒸水5 mL，6 mmol/L水楊酸-乙醇15 mL，于37℃水浴中保溫15 min，然后加入1 mL被測定樣品，搖勻，水浴37℃水浴中保溫15 min后取出，以超純水為參比，510 nm下測其吸光度（Ax0）。

按下式計(jì)算抑制率：

多糖對·OH 的抑制率/%＝[A0-（Ax-Ax0）]/A0×100式中：A0為用蒸餾水代替樣品的對照值；Ax為加樣后的吸光度；Ax0為樣品本身的本底值。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎麥多糖樣品濃度測定結(jié)果

根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.007097X-0.05023[式中：Y 為吸光度；x 為濃度，（μg/mL）]，計(jì)算樣品液濃度，結(jié)果如下：

在485 nm下測得苦蕎麥多糖提取液的吸光度Y=0.104，根據(jù)上述公式計(jì)算得到：X=21.7641 μg/mL。

2.2 苦蕎麥多糖對超氧陰離子自由基（O2-·）抑制作用的效果

分別取苦蕎麥多糖提取液 0.006、0.008、0.010、0.015、0.020 mL放入10 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，作為不同濃度的苦蕎麥多糖的樣品液，分別標(biāo)示為樣品1～樣品5。

每隔30 s所測鄰苯三酚自氧化的吸光度結(jié)果如表1。

表1 每隔30 s所測鄰苯三酚自氧化的吸光度Table 1 Absorbance of pyrogallol autoxidation at a distance from every 30 s

由表1得鄰苯三酚自氧化平均吸光度A0=0.064。

每隔30 s所測加入苦蕎麥多糖后鄰苯三酚自氧化的吸光度結(jié)果如表2。

表2 每隔30 s所測加入苦蕎麥多糖后鄰苯三酚自氧化的吸光度Table 2 Absorbance of pyrogallol autoxidation adding the polysaccharide in Tartary Buckwheat at a distance from every 30 s

苦蕎麥多糖對超氧陰離子自由基（O2-·）的抑制率：抑制率/%＝（A0-A1）/A0×100。

計(jì)算苦蕎麥多糖對超氧陰離子自由基（O2-·）的抑制率，所得結(jié)果見表3。

表3 苦蕎麥多糖對超氧陰離子自由基（O2-·）的抑制率Table 3 Inhibition of super oxygen in clearance in the polysaccharide compound in Tartary Buckwheat anion free radical（O2-·）

表3結(jié)果表明：苦蕎多糖對超氧陰離子有明顯的抑制作用，在樣品濃度為 0.013 μg/mL～0.044 μg/mL 的范圍內(nèi)隨加入多糖濃度越高，抑制作用越明顯。且當(dāng)多糖濃度為0.044μg/mL時(shí)，抑制率達(dá)到最高為82.81%。

2.3 苦蕎麥多糖對·OH抑制作用的效果

分別取苦蕎麥多糖提取液 5、6、7、8、9 mL 放入10 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，作為不同濃度的苦蕎麥多糖的樣品液，分別標(biāo)示為樣品1～樣品5。

根據(jù)公式，抑制率/%＝[A0-（Ax-Ax0）]/A0×100 計(jì)算抑制率，其結(jié)果如表4。

從表4結(jié)果表明：苦蕎麥多糖對羥基自由基也有抑制作用，且抑制率在10.882 μg/mL至19.588 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，是隨著多糖濃度的增大而增大的。當(dāng)多糖濃度為19.588 μg/mL時(shí)，抑制率達(dá)到最大為17.50%。

表4 苦蕎麥多糖對·OH抑制率Table 4 Inhibition in clearance in the polysaccharide compound in Tartary Buckwheat of the hydroxyl radical（·OH）

3 結(jié)論與討論

苦蕎麥作為一種傳統(tǒng)作物，其營養(yǎng)價(jià)值居所有糧食作物之首,不僅營養(yǎng)成分豐富，營養(yǎng)價(jià)值高，而且含有大量的多糖化合物。近代，隨著人們的生活水平的提高，人類對保健越來越重視，而多糖由于其獨(dú)特的保健功能而備受人們的關(guān)注。

多糖是由多個(gè)單糖分子縮合、失水而成，是一類分子機(jī)構(gòu)復(fù)雜且龐大的糖類物質(zhì)。通常具有貯藏生物能和支持結(jié)構(gòu)的作用。多糖類化合物廣泛存在于動(dòng)物細(xì)胞膜和植物、微生物的細(xì)胞壁中，是由醛基和酮基通過苷鍵連接的高分子聚合物，也是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一。20世紀(jì)50年代發(fā)現(xiàn)真菌多糖具有抗癌作用，后來又發(fā)現(xiàn)地衣、花粉及許多植物均含有多糖類化合物，并進(jìn)行分離提純，確定了其化學(xué)結(jié)構(gòu)、物理化學(xué)性質(zhì)、藥理作用，尤其對多糖類化合物的抗腫瘤和免疫增強(qiáng)作用進(jìn)行深入研究。

基于這兩大背景，對苦蕎麥多糖的抗氧化性進(jìn)行了研究。研究結(jié)果表明：苦蕎麥多糖對清除超氧陰離子自由基O2-和抑制·OH都有明顯的效果。尤其其多糖對清除超氧陰離子自由基的作用效果明顯高于對·OH的清除效果。

由本實(shí)驗(yàn)可以得到初步結(jié)論：苦蕎麥多糖具有抗氧化性，可成為衰老保健品輔料或功能因子。但其成分多樣，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，進(jìn)一步的純化和構(gòu)效關(guān)系研究需進(jìn)行。

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The Anti-Oxidation of Polysaccharide in Tartary Buckwheat

TAN Ping,FANG Yu-mei，WANG Yi-hong，ZHANG Chun-sheng
（Liu Panshui Normal College，Liupanshui 553004，Guizhou，China）

Aiming at the further exploration of the polysaccharide in Tartary Buckwheat resource,a study the antioxidant action of polysaccharide in Tartary Buckwheat is made.This text passes pyrogallol autoxidation method，the salicylic acid method colorimetry distinguishes to measure the super oxygen in clearance in polysaccharide compound in Tartary Buckwheat anion free radical（O2-·），the result of the hydroxyl radical（·OH）.The result expresses the polysaccharide in Tartary Buckwheat compound of the different density can show the super oxygen in a clearance anion free radicals with the free radicals of hydroxyl radical（·OH）.Go up along with the polysaccharide in Tartary Buckwheat compound density,its function of anti-oxidation will be strengthen gradually.

Tartary Buckwheat；polysaccharide；anti-oxidation；free radical

六盤水師范學(xué)院科研基金資助項(xiàng)目（2010-05）

譚萍（1963—），女（漢）,教授，本科，主要從事植物生理學(xué)與分子生物學(xué)的教學(xué)與研究。

2010-09-20