沈棚，牟德華 ，李艷，葉潤

（河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018）

牛胎盤廢棄物制備食品微生物培養(yǎng)基

沈棚，牟德華*，李艷，葉潤

（河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018）

采用廢棄牛胎盤下腳料為氮源制備新型培養(yǎng)基。并采用Plackett-Burman法、最陡爬坡試驗和響應(yīng)面試驗（Box-Behnken設(shè)計法）相結(jié)合的方法對大腸桿菌培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：牛胎盤下腳料經(jīng)水解后，替代LB培養(yǎng)基中的酵母浸粉，顯示出較高的生長水平。優(yōu)化后的新型培養(yǎng)基（NTP）組成為：葡萄糖2.8 g/L，NaCl 11 g/L，胰蛋白胨10.3 g/L，牛胎盤水解物16.7 g/L，pH 7.85，最終得到活菌數(shù)量較高的培養(yǎng)基配方。

牛胎盤；培養(yǎng)基；響應(yīng)面；優(yōu)化

胎盤在中醫(yī)藥學(xué)中稱為紫河車，是哺乳類胎生動物在懷胎時為胎兒供應(yīng)養(yǎng)分，促進(jìn)胚胎生長的特殊組織。它作為妊娠期間母體與胎兒進(jìn)行物質(zhì)交換的紐帶，具有重要的生理功能，可分泌多種激素、酶類；其組成成分復(fù)雜，含有多種蛋白質(zhì)、抗體、磷脂、生長因子、細(xì)胞因子及能刺激抗體免疫系統(tǒng)的小分子活性物質(zhì)[1-2]。目前關(guān)于牛胎盤在食品或食品用微生物培養(yǎng)方面的應(yīng)用研究較少，主要研究為提取其中少量的活性因子[3-4]。而剩余的大部分下腳料仍含有較高的蛋白質(zhì)，一直作為廢物丟棄，既污染環(huán)境又浪費蛋白質(zhì)資源。

響應(yīng)面分析方法，由一組數(shù)學(xué)和統(tǒng)計學(xué)方法組成?？捎糜诖_定各因素及其交互作用在加工過程中對非獨立變量的影響，精確地表述因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系?？煽焖儆行У卮_定多因子系統(tǒng)的最佳條件[5]。本試驗利用牛胎盤下腳料廢棄物，經(jīng)水解濃縮后，為微生物提供優(yōu)質(zhì)的氮源，制備新型培養(yǎng)基（NTP培養(yǎng)基），不僅降低了成本，還有很高的經(jīng)濟(jì)利潤，為畜牧業(yè)增加副產(chǎn)值。進(jìn)一步通過響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化大腸桿菌培養(yǎng)基，以期獲得活菌數(shù)量較高的培養(yǎng)基配方。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

大腸桿菌E.coliK12：河北科技大學(xué)微生物研究室保藏菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl1%，pH 7.0；

NTP培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，葡萄糖0.5%，牛胎盤水解物0.5%，NaCl 1%，pH 7.0。

1.1.3 試劑

復(fù)合蛋白酶：和氏璧生物技術(shù)有限責(zé)任公司；牛胎盤：河北君樂寶乳業(yè)有限公司提供。

1.2 儀器

YPW-I型迴轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜：上海通特電訊電設(shè)備廠；YXQ-LS-50S11立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-GJ-1BU潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋：河南省鞏義市英峪予華儀器廠；UV-2102 PCS型紫外可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理工藝

牛胎盤下腳料→烘干、粉碎→復(fù)合蛋白酶水解（加酶量 5000 U/g，溫度 53 ℃，pH6，料液比 1:10，水解2.5 h）→離心→牛胎盤水解液→濃縮→4℃冷藏

1.3.2 檢測方法

試驗采用比濁法測定培養(yǎng)液OD值。比濁法是根據(jù)細(xì)菌懸液細(xì)胞數(shù)與混濁度成正比，與透光度成反比關(guān)系，利用光電比色計測定細(xì)胞懸液的光密度（即OD值），用于表示該菌在本實驗條件下的相對生長量[6-7]。

測定方法：每隔一定時間間隔取樣搖勻，將大腸桿菌培養(yǎng)液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，使光密度在0.1～0.65之間，以沒有接種的空白對照組液體培養(yǎng)基調(diào)零點，在600 nm波長，1 cm比色杯中依次測定OD值，以光密度（OD值）為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，繪制大腸桿菌的生長曲線。

1.3.3 培養(yǎng)條件

種子培養(yǎng)條件：250 mL三角瓶裝種子培養(yǎng)基50 mL，接斜面活化后的種子一環(huán)，37℃，180 r/min，旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)18 h。

發(fā)酵培養(yǎng)條件：250 mL三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基50 mL，按照2%的接種量接種后在37℃，180 r/min，旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)24 h。

1.3.4 優(yōu)化方法

Plackett-Burma設(shè)計：本試驗在前期單因素試驗的基礎(chǔ)上選用N=12的Plackett-Burman設(shè)計法，對培養(yǎng)基的5個因素的重要性進(jìn)行考察，每個因素取高低2種水平，以培養(yǎng)液的OD600為響應(yīng)值，試驗設(shè)計見表1。用minitab15軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，比較各因素重要性。

最陡爬坡試驗：根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果，以各顯著因素的正負(fù)效應(yīng)確定最陡爬坡試驗的路徑（包括變化方向和變化步長），快速的逼近最大響應(yīng)區(qū)域。而其他因素的取值則根據(jù)正效應(yīng)因素均取較高值，負(fù)效應(yīng)因素均取較低值的原則。找到下一步響應(yīng)面分析的中心點。

Box-behnken設(shè)計：響應(yīng)面分析實驗方法根據(jù)PB試驗設(shè)計和最陡爬坡試驗結(jié)果，以最陡爬坡試驗得出中心點，設(shè)計三因素三水平的優(yōu)化試驗。用minitab軟件設(shè)計Box-Behnken響應(yīng)面實驗并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 NTP培養(yǎng)基試驗結(jié)果

分別采用NTP新型培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌的生長曲線如圖1所示。

圖1 NTP培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌生長曲線Fig.1 The growth curve of E.coli cultured by NTP medium

由圖1可知，當(dāng)采用相同含氮比例的牛胎盤水解液代替LB培養(yǎng)基中的酵母浸粉時，NTP新型培養(yǎng)基最終活菌含量略高于LB培養(yǎng)基，其原因是牛胎盤下腳料的蛋白水解液中，含有一定的活性多肽，有利于微生物的生長，表明采用NTP培養(yǎng)基適合于大腸桿菌的培養(yǎng)。

2.2 大腸桿菌培養(yǎng)基優(yōu)化

2.2.1 影響因素的篩選

按照Plackett-Burman設(shè)計，在培養(yǎng)穩(wěn)定期時取樣測定600 nm條件下的OD值，Plackett-Burman試驗設(shè)計及結(jié)果見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設(shè)計與結(jié)果Table 1 Design and results in Plackett-Burman experiment

對表1進(jìn)行回歸分析，所得結(jié)果列于表2。

表2 各因素水平、效應(yīng)值及顯著性分析Table 2 Factors，levels，effects of value and statistical analysis in Plackett-Burman experiment

由表2可看出，胰蛋白胨、牛胎盤水解物、pH、表現(xiàn)為正效應(yīng)，氯化鈉、葡糖糖表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)?？尚哦却笥?5%的因素為胰蛋白胨、牛胎盤水解物、pH，其中胰蛋白胨、牛胎盤水解物的可信度大于90%，影響顯著。因此確定胰蛋白胨、牛胎盤水解物、pH為主要影響因素進(jìn)行下一步試驗。

2.2.2 最陡爬坡試驗

根據(jù)表2分析結(jié)果確定不顯著因素的水平，表現(xiàn)為正效應(yīng)因素取較高值，表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)因素取較低值，安排如下:葡萄糖2.8 g/L，NaCl 11 g/L。顯著因素的變化步長及方向的試驗計及結(jié)果見表3。

從表3可看出，最佳因素濃度處于第4組與第5組實驗之間，第4組產(chǎn)量最高，因此以第4組的水平作為響應(yīng)面實驗的中心點，即胰蛋白胨8 g/L，牛胎盤水解物 14 g/L，pH7.7。

表3 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results in the steep hills experiment

2.2.3 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

通過最陡爬坡試驗確定了重要影響因素的取值區(qū)間。以胰蛋白胨、牛胎盤水解物及pH 3個重要因素為自變量，各因素編碼水平如表4所示。Box-behnken試驗設(shè)計及結(jié)果如表5所示。

表4 Box-Behnken設(shè)計的變量及水平Table 4 Variables and levels in Box-Behnken design

表5 Box-behnken設(shè)計及結(jié)果Table 5 Design and results in Box-Behnken

對試驗結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，得到回歸方程為:Y=-88.22-327.68X1-374.32X2+24.60X3-7683.17X12+2921.08X1X2+55.64X1X3-2.2457X22+80.19X2X3-1.69X32回歸方程的方差分析見表6。

從表6可以看出，模型是顯著的（P=0.002），失擬項p=0.063，表明失擬不顯著，方程的相關(guān)系數(shù)R2為0.9719，調(diào)整后的R2為0.9212。表明模型能解釋92.21%菌量的變化，回歸擬合程度較好，可以用此模型對培養(yǎng)液的活菌含量進(jìn)行預(yù)測。

表6 回歸方程的方差分析Table 6 The variance analysis of regression equation

2.2.4 最佳濃度的確定及驗證實驗

對回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到各響應(yīng)面立體分析圖，見圖2～圖4。

圖2 Y=f(X1，X2)的響應(yīng)面立體分析及其等高線圖Fig.2 Stereo analysis and contour map of the response surface,Y=f(X1,X2)

圖3 Y=f(X1,X3)的響應(yīng)面立體分析及其等高線圖Fig.3 Stereo analysis and contour map of the response surface,Y=f(X1,X3)

從圖2～圖4中可看出，兩兩因素間存在比較明顯的交互作用，最佳點落在實驗考察的區(qū)域內(nèi)。

由圖及軟件分析可知，回歸方程存在穩(wěn)定點。當(dāng)X1，X2，X3分別為：10.3、16.7 和 7.85 g/L 時，響應(yīng)值 Y達(dá)到最大值3.53，即培養(yǎng)液的活菌含量最高。所得的實際培養(yǎng)液OD600平均為3.49，與預(yù)測值接近，可見該模型能較好的預(yù)測實際情況；而在未優(yōu)化培養(yǎng)基條件下的培養(yǎng)液OD600=1.995，可見優(yōu)化后的培養(yǎng)基能顯著提高培養(yǎng)液中的活菌含量。

圖4 Y=f(X2,X3)的響應(yīng)面立體分析及其等高線圖Fig.4 Stereo analysis and contour map of the response surface,Y=f(X2,X3)

3 結(jié)論

以牛胎盤下腳料為原料，經(jīng)蛋白酶水解后，制備新型NTP培養(yǎng)基，用于大腸桿菌培養(yǎng)，可明顯提高活菌數(shù)量，從而實現(xiàn)了廢棄物再利用。

通過Plackett-Burman設(shè)計、最陡爬坡試驗及Box-behnken設(shè)計的方法確定大腸桿菌培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基為：葡萄糖2.8 g/L，NaCl 11 g/L，胰蛋白胨10.3 g/L，牛胎盤水解物16.7 g/L，pH 7.85。進(jìn)一步研究NTP培養(yǎng)基在其他微生物發(fā)酵培養(yǎng)中應(yīng)用，用牛胎盤下腳料水解物替代酵母浸粉能夠在微生物的大規(guī)模培養(yǎng)中提供質(zhì)優(yōu)的生長因子，具有很好的應(yīng)用前景。

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Using Bovine Placenta Scraps to Prepare Food Microbiology Medium

SHEN Peng,MOU De-hua*，LI Yan,YE Run
（College of Bioscience and Bioengineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，Hebei，China）

Bovine placenta scraps were used as a new nitrogen source for a new medium in this study.Plackett-Burman method,steep hills test and responses surface（Box-Behnken design）method were adopted to optimize the culture medium of the E.coli.Results showed that the E.coli had a higher growth level,after hydrolysis of bovine placenta scraps,which,thereafter,replaced yeast powder immersion in LB medium.The new optimized medium（NTP）was composed of glucose 2.8 g/L，NaCl 11 g/L，tryptone 10.3 g/L，bovine placenta hydrolysis content 16.7 g/L，pH 7.85.A medium formula with greater living bacterium content was achieved Eventually.

Bovine placenta；medium；responses surface methodology；optimization

河北科技大學(xué)生2010年度大學(xué)生科技創(chuàng)新基金項目（10253）

沈棚（1987—），男（漢），在讀本科生，研究方向：天然產(chǎn)物的分離研究。

*通信作者：牟德華（1960—），男，教授，主要從事農(nóng)產(chǎn)品深加工以及天然產(chǎn)物分離的研究。

2010-08-30