陽(yáng)元娥，譚偉

（1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510300；2.廣東工業(yè)大學(xué)，廣東 廣州 510006）

夏枯草總黃酮超聲提取工藝

陽(yáng)元娥1，譚偉2

（1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510300；2.廣東工業(yè)大學(xué)，廣東 廣州 510006）

研究超聲波輔助提取夏枯草總黃酮的最佳提取工藝條件?？疾煲掖紳舛?、料液比、提取溫度、超聲功率及提取時(shí)間對(duì)夏枯草總黃酮提取率的影響，并在此基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面分析法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。以上因素對(duì)夏枯草總黃酮的提取率都有一定的影響，最佳提取工藝條件如下：乙醇濃度為60%；料液比為1:12（g/mL）；提取溫度為61.4℃；超聲功率為150 W；提取時(shí)間為40 min。在此條件下，夏枯草總黃酮的提取率可達(dá)到7.92%。

超聲波；夏枯草；黃酮；提??；曲面響應(yīng)

夏枯草，學(xué)名Prunella vulgaris L.，為唇形科夏枯草屬植物夏枯草的干燥果穗，一般取其干燥果實(shí)入藥。夏枯草是一種療效確切的常用中草藥，其有效成分黃酮類化合物具有重要的藥理作用和保健功能[1]，在制藥、食品、日用化工等行業(yè)具有廣泛的用途。夏枯草主要含有三萜及其苷類、黃酮類、甾醇及其苷類、香豆素、有機(jī)酸、揮發(fā)油及糖類等成分。黃酮的傳統(tǒng)提取方法有水提法[2]、有機(jī)溶劑提取法[3]，新型提取方法有微波法[4]、超聲波法[5-6]和超臨界流體萃取法[7-8]等。本研究采用操作方便、成本低廉的超聲輔助法提取夏枯草總黃酮，并對(duì)其工藝進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料與設(shè)備

夏枯草生藥材：市售，經(jīng)鑒定為唇形科植物夏枯草的干燥果穗。蘆丁對(duì)照品：購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；亞硝酸鈉：汕頭光華化學(xué)廠生產(chǎn)；硝酸鋁：廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；氫氧化鈉：洛陽(yáng)市化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；其他為分析純。

KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)；DF-20型流水式高速中藥粉碎機(jī)：溫嶺市大德中藥機(jī)械有限公司生產(chǎn)；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；1201型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京瑞利分析儀器公司生產(chǎn)；電子天平：上海精天電子儀器有限公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制[9]

精密稱取于蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20.0 mg，用60%乙醇（體積分?jǐn)?shù)，下同）溶解，并完全轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，用60%乙醇定容定容后搖勻，得0.200 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL 于 10 mL 容量瓶中，用 60%乙醇補(bǔ)至約5 mL，加入0.3 mL 5%NaNO2溶液，搖勻，放置5 min后加入0.3 mL 10%Al（NO3）3溶液，搖勻，放置6 min后再加入4 mL 1 mol/L NaOH溶液，搖勻，用60%乙醇補(bǔ)足至刻度，放置15 min后在510 nm處測(cè)定其吸光值。以質(zhì)量濃度對(duì)吸光值作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖1）。以濃度與吸光值進(jìn)行線性回歸。得到回歸方程A=11.5167 C+0.032[A為吸光度，C為濃度（mg/mL）]，相關(guān)系數(shù)為r=0.9964。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線則可計(jì)算出提取液中黃酮的含量。

2.2 黃酮含量測(cè)定方法

吸取待測(cè)液1 mL，加入到10 mL的容量瓶中，用60%乙醇補(bǔ)至約5 mL，加入0.3 mL 5%NaNO2溶液，搖勻，放置5 min后加入0.3 mL 10%Al（NO3）3溶液，搖勻，放置6 min后再加入4 mL 1 mol/L NaOH溶液，搖勻，用60%乙醇補(bǔ)足至刻度，放置15 min后在510 nm處測(cè)定其吸光值，用空白試劑作參比，得夏枯草總黃酮的吸光值。

2.3 提取實(shí)驗(yàn)操作

準(zhǔn)確稱取過(guò)40目篩的夏枯草2.0 g，加入到100 mL的三頸燒瓶中，加入不同濃度的乙醇溶液，放置到水浴恒溫槽中進(jìn)行超聲作用，調(diào)節(jié)提取溫度和超聲波功率，在不同的提取時(shí)間內(nèi)進(jìn)行超聲提取夏枯草總黃酮實(shí)驗(yàn)。在固定其他參數(shù)的情況下，分別考察了乙醇濃度、液料比、超聲功率、超聲提取時(shí)間以及超聲提取次數(shù)對(duì)夏枯草黃酮萃取率的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計(jì)，以總黃酮提取率為響應(yīng)值，通過(guò)響應(yīng)面曲面分析（Response surface analysis，RSA）對(duì)提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。

3 結(jié)果與討論

3.1 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響

在料液比 1:10（g/mL）、提取溫度 60 ℃、超聲波功率150W、超聲處理時(shí)間30min，考察乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%時(shí)總黃酮提取率變化，結(jié)果如圖1所示。

圖1 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids

由圖1可見(jiàn)，當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，夏枯草總黃酮的提取率最高，再低于或高于此乙醇濃度，提取率都下降，因此，乙醇濃度以60%為宜。

3.2 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響

根據(jù)3.1結(jié)果，選擇乙醇濃度為60%、提取溫度60℃、超聲波功率150 W、超聲處理時(shí)間30 min，考察料液比分別為 1:8、1:10、1:12、1:14、1:16（g/mL）對(duì)總黃酮提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ration of solvent to sample on extraction yield of total flavonoids

由圖 2可見(jiàn)，當(dāng)料液比由 1:8（g/mL）上升至1:12（g/mL）時(shí)，增加溶劑能夠促進(jìn)夏枯草中總黃酮的浸出。隨后，夏枯草總黃酮的提取率有所下降。因此，選取 1:12（g/mL）的料液比為宜。

3.3 提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

根據(jù) 3.2 結(jié)果，選擇料液比為 1:12（g/mL）、乙醇濃度為60%、超聲波功率150 W、超聲處理時(shí)間30 min，考察提取溫度 50、55、60、65、70 ℃對(duì)總黃酮提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction yield of total flavonoids

由圖3可見(jiàn)，在溫度50℃～60℃之間隨著溫度的升高，總黃酮的提取率也逐漸增加，當(dāng)高于60℃時(shí)，提取率不再增加反而出現(xiàn)降低趨勢(shì)。這說(shuō)明在較高溫度下夏枯草總黃酮可能不穩(wěn)定發(fā)生降解，從而影響總黃酮的提取率。因此提取最佳溫度應(yīng)該控制在60℃。

3.4 超聲功率對(duì)總黃酮提取率的影響

根據(jù)3.3結(jié)果，選擇提取溫度60℃、料液比為1:12（g/mL）、乙醇濃度為 60%、超聲處理時(shí)間 30 min，考察超聲波功率 40、60、90、120、150 W 對(duì)總黃酮提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

從圖4可以看出，隨著超聲波功率的增大總黃酮的提取率隨之增加，表明超聲波功率增大有利于總黃酮的溶出，限于超聲波最大功率為150 W，因此選擇150 W為宜。

圖4 超聲功率對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasound power on extraction yield of total flavonoids

3.5 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

根據(jù)3.4結(jié)果，選擇超聲功率150 W，料液比為1:12（g/mL）、乙醇濃度為 60%，提取溫度 60 ℃、考察提取時(shí)間分別為 20、30、40、50、60 min 對(duì)總黃酮提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction yield of total flavonoids

從圖5可知，總黃酮提取率隨著提取時(shí)間的增加，總體趨勢(shì)是上升。而在超聲波處理時(shí)間大于40 min后提取率增加幅度很小，說(shuō)明長(zhǎng)時(shí)間的超聲波作用對(duì)總黃酮的提取不會(huì)產(chǎn)生明顯的作用，而且考慮到縮短工時(shí)減少能耗，因此提取時(shí)間以40 min為宜。

3.6 超聲提取夏枯草黃酮工藝優(yōu)化[10]

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上。選擇乙醇濃度、溫度和超聲功率3個(gè)主要參數(shù)對(duì)超聲提取夏枯草黃酮的工藝進(jìn)行優(yōu)化，采用Design-expert（V7.0）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。其他參數(shù)料液比和超聲提取時(shí)間分別固定為1:12（g/mL）和40 min。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得到二次回歸方程：

表1 三因素三水平Box-Behnken設(shè)計(jì)以及總黃酮提取率的實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值Table 1 Three levels Box-Behnken design with three independent variables,and the experimental and predicted yields of total flavonoids

Y=7.64-0.036A+0.048B+0.046C+0.0025AB+0.14AC-0.017BC-0.40A2-0.063B2+0.24C2

式中：A為乙醇濃度，%；B為提取溫度，℃；C為超聲功率，W；相關(guān)系數(shù)r2=0.9928。對(duì)表1實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化后得到在乙醇濃度60%，提取溫度61.4℃超聲功率為150 W優(yōu)化條件下，預(yù)測(cè)最高提取率為7.93%。通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到提取率為7.92%，實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值非常接近，無(wú)顯著差異。

4 結(jié)論

1）乙醇濃度、料液比、超聲功率、超聲提取時(shí)間、提取溫度主要參數(shù)對(duì)夏枯草總黃酮的提取率都存在一定的影響。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙醇濃度為60%時(shí)提取率高；料液比為1:12（g/mL）比較合適；提取溫度60℃；超聲提取時(shí)間40 min；超聲功率為150 W。

2）通過(guò)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)得到超聲提取夏枯草總黃酮的優(yōu)化工藝條件：在乙醇濃度為60%、料液比為1:12（g/mL）、提取溫度為 61.4℃、超聲功率為 150 W、提取時(shí)間40 min。并在此條件下夏枯草總黃酮的提取率達(dá)到了7.92%。

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Technics of Ultrasound-assisted Extraction of Total Flavonoids in Prunella vulgaris L.

YANG Yuan-e1,TAN Wei2
（1.Guangdong Industry Technical College，Guangzhou 510300，Guangdong,China；2.Guangdong University of Technology，Guangzhou 510006，Guangdong,China）

Optimum extraction conditions of total flavonoids in Prunella vulgaris L.adopted ultrasound were studied.Effects of factors such as ethanol concentration，ration of solvent to sample,ultrasound power,extraction temperature and extraction time on extraction yield of total flavonoids in Prunella vulgaris L.had been investigated.On the basis of experimental results of single factor，experimental design of Box-Behnken was carried out and optimum extraction conditions were obtained.Extraction yield of total flavonoids in Prunella vulgaris L.reached 7.92%under the following conditions:ethanol of 60%condition,solvent to sample ratio 1:12（g/mL）,extraction temperature 61.4 ℃,ultrasound power 150 W and extraction time 40 min.

ultrasoud;Prunella vulgaris L.;flavonoid;extraction;response surface analysis

陽(yáng)元娥（1974—），女（漢），講師，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物提取與應(yīng)用生物技術(shù)。

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（8451009001001374）

2010-09-11