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        低溫提取南瓜多糖的理化性質(zhì)及清除DPPH自由基作用

        2011-12-05 09:15:00于斐李全宏
        食品研究與開(kāi)發(fā) 2011年4期
        關(guān)鍵詞:研究

        于斐,李全宏

        (中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083)

        低溫提取南瓜多糖的理化性質(zhì)及清除DPPH自由基作用

        于斐,李全宏*

        (中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083)

        首次采用低溫水提的方法對(duì)南瓜多糖進(jìn)行提取,從得率、理化性質(zhì)、清除DPPH自由基活性方面對(duì)低溫提取的南瓜多糖進(jìn)行了研究,并與高溫提取的南瓜多糖進(jìn)行了比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:經(jīng)緩凍處理后,室溫提取的南瓜多糖得率為5.06%,低于70℃提取的多糖得率5.48%(P>0.05)。低溫提取的南瓜多糖為白色粉末,I2-KI反應(yīng)陰性,分子量分布主要為4 ku~270 ku;低溫南瓜多糖清除DPPH自由基的效果明顯高于高溫提取的南瓜多糖(P<0.05)。

        南瓜;多糖;低溫;性質(zhì);DPPH自由基

        活性多糖是多糖中具有生物生理活性和特殊保健功能的一類(lèi)物質(zhì)。20世紀(jì)50年代,日本科學(xué)家首次發(fā)現(xiàn)香菇中存在能抗輻射和抑制腫瘤生長(zhǎng)甚至使腫瘤縮小的物質(zhì),后證實(shí)這種物質(zhì)是香菇多糖[1]。隨后,國(guó)內(nèi)外科學(xué)家掀起了一股研究開(kāi)發(fā)活性多糖的熱潮 ,目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道活性多糖的藥理功能有:增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、抗突變、抗輻射、抗病毒、降血糖、降血脂等[2]。目前南瓜多糖多采用熱水浸提的方法獲得,張擁軍等采用60℃~100℃熱水提取[3],孔慶勝等采用了甲醇回流,煮沸6 h來(lái)提取[4]。根據(jù)研究報(bào)道,很多天然物質(zhì)在高溫時(shí),易受到破壞,使其生物活性降低或喪失。但是多糖的結(jié)構(gòu)和功能會(huì)不會(huì)受到高溫的影響,低溫提取的南瓜多糖(LTPP)與高溫提取的南瓜多糖(HTPP)有什么差異,目前尚鮮見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。因此,本課題就低溫提取的南瓜多糖的性質(zhì)進(jìn)行了研究,并將其與高溫提取的南瓜多糖的性質(zhì)進(jìn)行了比較。這一研究為活性多糖的研究提供了新的方向,也為今后的研究奠定了理論基礎(chǔ)。

        根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[5-6],緩凍能明顯提高南瓜多糖提取得率,尤其是緩凍的效果更為明顯,為了準(zhǔn)確、高效的提取分離到南瓜多糖的功能性成分,在實(shí)驗(yàn)中采用緩凍強(qiáng)化,低溫提取的方法提取南瓜粗多糖。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        南瓜:購(gòu)于市場(chǎng);DPPH、葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品:sigma公司;透析袋MW3500:美國(guó);其他試劑均為分析純:購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)。

        TGL-16A臺(tái)式高速冷凍離心機(jī):長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司;2802紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):尤尼科(上海儀器有限公司;液相:德國(guó)KNUAER公司;RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:上海亞榮生化儀器廠。

        1.2 方法

        1.2.1 南瓜多糖的提取[7]

        準(zhǔn)確稱(chēng)取緩凍后的南瓜100 g,切塊,打磨成漿,以料液比 1:4(g:mL)加入去離子水,浸提一定時(shí)間,4 層絹布過(guò)濾,收集濾液,45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原體積的1/2。濃縮液即為南瓜多糖提取液。

        1.2.2 脫蛋白

        采用 Sevag 法進(jìn)行。按多糖:氯仿:正丁醇=15:4:1的比例(體積比)振蕩混,4000 r/min離心分離,反復(fù)進(jìn)行多次,直至無(wú)白色沉淀為止。

        1.2.3 醇沉

        將無(wú)水乙醇緩慢加入到濃縮后的多糖溶液中,乙醇終濃度為75%,于4℃冰箱中醇沉12 h,4200 r/min離心20 min,收集沉淀,即得南瓜多糖。

        1.2.4 透析

        將樣品溶液裝入透析袋中,于去離子水中透析72h,以去除離子、小分子物質(zhì)和多肽。

        1.2.5 冷凍干燥

        將透析液液進(jìn)行凍干,最后得白色粉狀南瓜多糖粗品。

        1.3 測(cè)定方法

        1.3.1 多糖含量測(cè)定[8-9]

        采用硫酸-苯酚法進(jìn)行測(cè)定。

        1.3.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定[8-9]

        采用Folin-酚法進(jìn)行測(cè)定。

        1.3.3 還原糖含量測(cè)定[10]

        DNS法。

        1.3.4 平均聚合度測(cè)定[11]

        平均聚合度=總糖含量/還原糖含量。

        1.4 理化性質(zhì)分析

        1.4.1 Molish反應(yīng)[12]

        取1 mL南瓜多糖溶液(1 mg/mL)置于試管中,加入2滴5%α-萘酚-乙醇溶液,揺勻,將試管傾斜,沿試管壁緩緩加入1 mL濃硫酸,豎直試管,觀察濃硫酸和糖交界面顏色的變化。以純水作陰性對(duì)照,淀粉溶液(1 mg/mL)作陽(yáng)性對(duì)照。

        1.4.2 硫酸-蒽酮反應(yīng)[12]

        取1 mL南瓜多糖溶液(1 mg/mL)置于試管中,加入新配制的蒽酮試劑。搖勻,于沸水浴中加熱10 min,取出冷至室溫,觀察顏色變化。對(duì)照同1.4.1。

        1.4.3 碘-碘化鉀反應(yīng)[13]

        取1 mL南瓜多糖溶液(1 mg/mL)置于試管中,加入I2-KI溶液,觀察顏色變化。對(duì)照同1.4.1。

        1.4.4 分子量測(cè)定

        色譜條件:Shodex SB-805 HQ,流動(dòng)相0.1 mol/L NaNO3,流速 0.5 mL/min,柱溫 35 ℃。

        標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:取適量葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品T5、T12、T25、T50、T270、T670溶于純水??傻梅肿恿颗c出峰時(shí)間的關(guān)系。

        樣品測(cè)定方法同上。

        1.5 DPPH自由基清除作用的測(cè)定[14]

        取一定濃度的糖溶液1.5 mL,加入0.2 mmol/L的DPPH自由基溶液3 mL,混勻后,25℃靜置20 min后在517 nm處測(cè)吸光度值。以蒸餾水代替樣品作為空白,以酒精溶液代替DPPH-乙醇溶液作為對(duì)照。

        DPPH 自由基清除率=[1-(Asample-Acontrol)/Ablank]×100%

        2 結(jié)果與討論

        2.1 南瓜多糖得率

        不同提取條件對(duì)南瓜多糖得率的影響見(jiàn)圖1。

        圖1 不同提取條件下南瓜多糖的得率Fig.1 The yield of pumpkin polysaccharides at different conditions

        由圖1可知,緩凍后南瓜多糖的得率明顯高于未緩凍的樣品,這是由于緩凍過(guò)程中破壞了南瓜的細(xì)胞壁,更有利于多糖的溶出。高溫也可以使南瓜細(xì)胞“崩解”促進(jìn)多糖的溶出。緩凍和高溫都可以起到破壁的作用,因此HTPP的得率雖然高于LTPP的得率,但是并沒(méi)有顯著的差別,而且隨著時(shí)間的延長(zhǎng),高溫提取的南瓜多糖的得率反而降低,可能是高溫條件破壞了某些糖類(lèi)的結(jié)構(gòu)。因此,LTPP選擇25℃,提取6 h;HTPP選擇70℃提取4 h。

        2.2 南瓜多糖的理化性質(zhì)

        南瓜多糖的理化性質(zhì)見(jiàn)表1。

        表1 南瓜多糖的理化性質(zhì)Table 1 The Physicochemical properties of polysaccharide

        南瓜多糖為白色粉末,溶于水,由表1可知,Molish反應(yīng)呈陽(yáng)性,硫酸-蒽酮反應(yīng)呈陽(yáng)性,說(shuō)明提取物為多糖,I2-KI反應(yīng)呈陰性,說(shuō)明為非淀粉性多糖。Sevag法可以脫除游離蛋白,經(jīng)脫蛋白后LTPP的蛋白含量明顯高于HTPP,這可能是由于LTPP含有較多的南瓜糖蛋白復(fù)合物,從而使兩者的功能性質(zhì)產(chǎn)生差異。根據(jù)平均聚合度和分子量分布圖,可知LTPP的分子量要低于HTPP,尤其是高分子量組分比較低。這也解釋了LTPP溶解度較高的原因。

        多糖標(biāo)品的分布如圖2所示,根據(jù)圖2計(jì)算得多糖分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)曲線:logM=-0.5501x+14794 R2=0.9878。根據(jù)樣品的出峰時(shí)間,即可計(jì)算出樣品的分子量分布范圍,LTPP和HTPP的分子量見(jiàn)圖3,計(jì)算可得,LTPP的分子量范圍為:4 ku~270 ku;HTPP的分子量范圍為:4 ku~270 ku。

        圖2 多糖標(biāo)品的分子量分布圖Fig.2 The molecular weight distribution of polysaccharide standard

        2.3 清除DPPH自由基的作用

        DPPH自由基是一種比較穩(wěn)定的自由基,與其他自由基評(píng)價(jià)抗氧化的方法相比,DPPH自由基方法能夠快速的反應(yīng)樣品的抗氧化活性。南瓜多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用見(jiàn)圖4。

        圖3 南瓜多糖的分子量分布圖Fig.3 The molecular weight distribution of pumpkin polysaccharide

        圖4 南瓜多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.4 The DPPH radical scavenging activity of punpkin polysaccharide

        由圖4可知,南瓜多糖對(duì)DPPH自由基有明顯地清除作用,清除率和多糖的含量存在著一定的量效關(guān)系。這可能與南瓜多糖分子中的還原性的半縮醛羥基有關(guān)。南瓜多糖在2 mg/mL~5 mg/mL的范圍能夠有效的清除DPPH自由基,達(dá)到50%清除率需要LTPP的量為3.6 mg/mL。LTPP對(duì)DPPH自由基的清除作用要好于HTPP,尤其是在濃度增大時(shí)。其它抗氧化活性實(shí)驗(yàn)以及其抗氧化機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

        3 結(jié)論

        本文對(duì)低溫提取南瓜多糖的性質(zhì)進(jìn)行了研究,LTPP為白色粉末,主要為分子量分布范圍為4 ku~270 ku的非淀粉多糖。緩凍處理可以有效提高南瓜多糖得率,而且低溫提取可以節(jié)約大量能源,降低生產(chǎn)成本,實(shí)現(xiàn)環(huán)保生產(chǎn)。對(duì)南瓜多糖抗氧化的初步研究表明南瓜多糖具有良好的DPPH自由基清除作用,但對(duì)南瓜多糖的其他功能活性,尤其是高純度的LTPP的藥理作用,目前尚需進(jìn)一步研究,為開(kāi)發(fā)保健品和高附加值的工業(yè)化南瓜產(chǎn)品,提供理論依據(jù)。

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        The Physicochemical Properties and Radical Scavenging Activity of Pumpkin Polysaccharides Extracted at Low Temperature

        YU Fei,LI Quan-hong*
        (College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China)

        Crude water-soluble pumpkin polysaccharides were extracted from pumpkin pulp at room temperature(25 ℃).The yield,physicochemical properties and DPPH radical scavenging activity of polysaccharides were studied and compared with which obtained at 70℃.The results indicated that after slow freezing treatment,the yield of polysaccharides extracted at 25℃ was 5.06%and that extracted at 70℃ was 5.48%.Their difference was not obviously.The pumpkin polysaccharides obtained at 25℃were white in colour,non-strach,and molecular weight ranged from 4 ku to 270 ku.Moreover the DPPH radical scavenging activity was higher than the polysaccharide obtained at 70℃.

        pumpkin;polysaccharide;low temperature;propery;DPPH radical

        自然基金(3067146)

        于斐(1986—),女(漢),碩士研究生,研究方向:果蔬加工。

        *通信作者:李全宏(1966—),男,博士生導(dǎo)師,教授,研究方向:農(nóng)產(chǎn)品加工與綜合利用。

        book=202,ebook=202

        2010-08-31

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