張曉旭 ，趙國(guó)琦 ，*，錢(qián)利純 ，曹崇海

（1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.浙江大學(xué)飼料科學(xué)研究所，浙江 杭州 310029）

木瓜蛋白酶水解甲魚(yú)蛋白工藝條件的優(yōu)化

張曉旭1，趙國(guó)琦1，*，錢(qián)利純2，曹崇海2

（1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.浙江大學(xué)飼料科學(xué)研究所，浙江 杭州 310029）

對(duì)木瓜蛋白酶水解甲魚(yú)蛋白的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，探討了酶量、溫度、pH、酶解時(shí)間對(duì)木瓜蛋白酶水解甲魚(yú)蛋白的影響，運(yùn)用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)法，對(duì)四因素進(jìn)行研究，確定了木瓜蛋白酶水解甲魚(yú)蛋白的最優(yōu)酶解參數(shù)。實(shí)驗(yàn)表明四因素對(duì)甲魚(yú)蛋白水解度的影響大小依次為：酶用量＞pH＞時(shí)間＞溫度，木瓜蛋白酶水解甲魚(yú)蛋白的最佳酶解工藝條件為：酶用量14350.77 U/kg，反應(yīng)溫度69℃，pH 7.30，反應(yīng)時(shí)間7 h。在此優(yōu)化工藝條件下甲魚(yú)蛋白的水解度可達(dá)19.53%。

木瓜蛋白酶；甲魚(yú)蛋白；二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)；優(yōu)化

甲魚(yú)，又稱(chēng)鱉、團(tuán)魚(yú)，是一種珍貴的水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，自古以來(lái)就被視為食療滋補(bǔ)的佳品，其肉質(zhì)鮮嫩味美，且富含豐富的蛋白質(zhì)、鈣、磷、鐵、硫胺素、核黃素及尼克酸等營(yíng)養(yǎng)成分，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及藥用價(jià)值[1-4]。近年來(lái)，隨著人工養(yǎng)殖技術(shù)的快速發(fā)展，甲魚(yú)市場(chǎng)出現(xiàn)了供大于求的現(xiàn)象，只有將甲魚(yú)經(jīng)過(guò)科學(xué)的加工處理，提取其有效成分，制成易消化吸收、即食性強(qiáng)的營(yíng)養(yǎng)保健食品，才能提高甲魚(yú)的利用率及消費(fèi)量，并使甲魚(yú)的保健作用得到充分發(fā)揮[5]。其中甲魚(yú)的酶解技術(shù)是甲魚(yú)食品生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)[6]。由于酸法水解和堿法水解條件比較劇烈，對(duì)甲魚(yú)的營(yíng)養(yǎng)成分破壞很大，同時(shí)水解產(chǎn)物的口感和風(fēng)味不佳。而酶法酶解條件溫和，效率高，酶解后營(yíng)養(yǎng)成分損失少[7],徐懷德[8]報(bào)道甲魚(yú)木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物的抗氧化性最好，因此在本試驗(yàn)中我們選用木瓜蛋白酶水解甲魚(yú)蛋白。

本實(shí)驗(yàn)采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)對(duì)木瓜蛋白酶水解甲魚(yú)蛋白的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定木瓜蛋白酶水解甲魚(yú)蛋白的最佳水解條件，為甲魚(yú)深加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲魚(yú)由杭州中得實(shí)業(yè)有限公司提供；木瓜蛋白酶（360000 U/g）由廣西南寧龐博生物工程有限公司提供。

DK-8D型電熱恒溫水槽：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Centrifuge 5804R型高速冷凍離心機(jī)：eppendorf，德國(guó)生產(chǎn)；雷磁PHS-3C型pH計(jì)：上海精科雷磁儀器廠(chǎng)；AG 204型分析天平:METTLETOLEDO,瑞士生產(chǎn)；T6-新悅可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；J-6型多頭磁力加熱攪拌器：江蘇金壇榮華儀器制造有限公司；JJ-2B組織勻漿機(jī)：金壇市精達(dá)儀器制造廠(chǎng)；微量凱氏定氮儀。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

甲魚(yú)→宰殺→熱燙去皮膜（95℃,10 s～15 s）→去內(nèi)臟→去脂肪→高壓蒸煮→去骨→勻漿（按質(zhì)量體積比1:10）→制成勻漿液→測(cè)勻漿液中總氮含量→在不同酶解條件下酶解→滅酶（95℃,15 min）→4000 r/min，離心5 min→測(cè)酶解液中氨基態(tài)氮含量

1.2.2 酶活的測(cè)定

采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)法測(cè)定[9]。

酶活力的定義：1 min內(nèi)水解標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白釋放出的三氯乙酸可溶物在275 mm處的吸光度與1 μg酪氨酸相當(dāng)時(shí)所需的酶量為1個(gè)酶活力單位（U）。

1.2.3 總氮含量的測(cè)定

采用凱氏定氮法（GB/T 6432-1994）測(cè)定。

1.2.4 氨基態(tài)氮含量的測(cè)定

采用甲醛滴定法[10]測(cè)定。

1.2.5 水解度的測(cè)定

水解度=氨基氮/總氮×100%

1.2.6 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.6.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別研究酶量（6000、9000、12000、15000、18000 U/kg）、溫度（50、55、60、65、70 ℃）、pH（6、6.5、7、7.5、8）、時(shí)間（5、6、7、8、9 h）對(duì)木瓜蛋白酶水解甲魚(yú)蛋白參數(shù)的影響。

1.2.6.2 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果分析確定各因素水平范圍，取單因子試驗(yàn)中效果較好的參數(shù)作為各因素的零水平進(jìn)行四元五次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)[11-13]，參試因子的水平設(shè)置及編碼見(jiàn)表1。影響模型的建立是根據(jù)系統(tǒng)分析的觀(guān)點(diǎn)采用四因子（1/2實(shí)施）二次正交旋轉(zhuǎn)回歸組合設(shè)計(jì)表2。每一參試因子的水平編碼為-1.682，-1，0，1，1.682，整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè) 23 個(gè)組合，依各組條件操作，測(cè)得各組氨基態(tài)氮含量，計(jì)算出相應(yīng)的水解度。然后用SAS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，從而確定木瓜蛋白酶水解甲魚(yú)蛋白的最佳酶解方案。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶量對(duì)酶解效果的影響

設(shè)定底物濃度為10%，酶解溫度為45℃，pH為7，酶解時(shí)間為 6 h，分別添加 6000、9000、12000、15000、18000 U/kg的酶量，來(lái)研究木瓜蛋白酶的用量對(duì)酶解效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 酶量對(duì)水解度的影響Fig.1 Effects of dosage of enzyme on DH

由圖1可見(jiàn)，甲魚(yú)蛋白的水解度隨著酶用量的增加而增大?？紤]到酶解的成本，木瓜蛋白酶的用量在9000 U/kg～15000 U/kg均可達(dá)到較理想的水解效果。

2.1.2 溫度對(duì)酶解效果的影響

設(shè)定酶解時(shí)木瓜蛋白酶的用量為9000 U/kg，在底物濃度為10%，pH為7，酶解時(shí)間為6 h的條件下，分別設(shè)定酶解溫度為 50、55、60、65、70 ℃來(lái)研究溫度對(duì)酶解效果，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 溫度對(duì)水解度的影響Fig.2 Effects of temperature on DH

由圖2可以看出，當(dāng)溫度50℃～65℃范圍時(shí)，隨著溫度的升高，水解度有所提高，當(dāng)溫度高于65℃時(shí)，水解度反而下降，這是由于溫度過(guò)高導(dǎo)致酶或者蛋白質(zhì)的變性，不利于水解的進(jìn)行。木瓜蛋白酶水解甲魚(yú)蛋白的溫度在60℃～70℃之間水解效果較為理想。

2.1.3 pH對(duì)酶解效果的影響

設(shè)定底物濃度為10%，酶量為9000 U/kg，酶解溫度為 45℃，酶解時(shí)間為 6 h，pH 在 6、6.5、7、7.5、8之間變動(dòng)，所得結(jié)果如圖3所示。

由pH對(duì)酶解效果的影響圖可以看出，在pH為7.5時(shí)木瓜蛋白酶水解甲魚(yú)蛋白的水解度達(dá)到最高，當(dāng)酶解液pH>7.5時(shí)，水解度下降，這可能與堿性環(huán)境使木瓜蛋白酶變性失活有關(guān)。

圖3 pH對(duì)水解度的影響Fig.3 Effects of pH on DH

2.1.4 時(shí)間對(duì)酶解效果的影響

設(shè)定底物濃度為10%，酶量為9000 U/kg，酶解溫度為 45 ℃，pH 為 7,考察酶解 5、6、7、8、9 h 對(duì)酶解效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 時(shí)間對(duì)水解度的影響Fig.4 Effects of time on DH

如圖4所示，起初隨著水解時(shí)間增加，水解度不斷增大，當(dāng)水解的時(shí)間達(dá)到8 h后，繼續(xù)延長(zhǎng)水解時(shí)間，水解度基本保持不變，這說(shuō)明8 h時(shí)，酶與底物的結(jié)合已基本達(dá)到飽和，繼續(xù)延長(zhǎng)作用時(shí)間對(duì)酶解效果已沒(méi)有影響，因此木瓜蛋白酶水解甲魚(yú)蛋白的最佳反應(yīng)時(shí)間為8 h。

2.1.5 小結(jié)

經(jīng)過(guò)單因素試驗(yàn)，水解效果較好的參數(shù)為：酶量9000 U/kg～15000 U/kg,溫度 60 ℃～70 ℃，pH 7.5,反應(yīng)時(shí)間為8 h。

2.2 二次旋轉(zhuǎn)正文試驗(yàn)結(jié)果與統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇優(yōu)化因子的上下限范圍，得到因素水平編碼表（表1），試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.1 數(shù)學(xué)模型的建立

用Microsoft Execl對(duì)二次回歸旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法對(duì)表2試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合，得到水解度的回歸方程：

表1 因素水平編碼表Table 1 Code table of factor level

表2 二次回歸旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Design and results of quadric regression orthogonal rotational experiment

2.2.2 模型顯著性檢驗(yàn)

為檢驗(yàn)回歸方程的有效性，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，按 F失擬=失擬均方/誤差均方、F回歸=回歸均方/剩余均方進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，F(xiàn)失擬＝4.5173＜F0.05（2，6），失擬項(xiàng)在 α=0.05 水平上不顯著（P>0.05），表明模型擬合是合適的；F回歸=5.6560＞F0.01（14，8），達(dá)極顯著水平（P＜0.01），說(shuō)明回歸方程是極顯著的。

甲魚(yú)蛋白的水解度與酶用量、溫度、pH以及作用時(shí)間的相關(guān)系數(shù)R2=回歸平方和/總平方和=90.82%，表明該數(shù)學(xué)模型4個(gè)因素對(duì)產(chǎn)量的影響占90.82%，而其它因素的影響和誤差僅占9.18%。

對(duì)回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，在α=0.10顯著水平剔除不顯著項(xiàng)后，得到優(yōu)化后的方程為：

表3 水解度試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 3 Variance analysis of experimental results

2.2.3 交互效應(yīng)分析

通過(guò)對(duì)回歸方程的分析可知，酶用量與溫度、pH以及時(shí)間之間存在拮抗作用；而溫度與pH以及時(shí)間之間存在協(xié)同作用。

2.2.4 蛋白質(zhì)水解度主要因素效應(yīng)分析

用“降維法”將任意3個(gè)因素固定在零水平，得到另一個(gè)因素與水解度的效應(yīng)方程：

根據(jù)回歸系數(shù)（絕對(duì)值）可知4個(gè)因素對(duì)甲魚(yú)蛋白水解度（%）的影響順序?yàn)椋好赣昧浚╔1）＞pH 值（X3）＞時(shí)間（X4）＞溫度（X2）。

2.2.5 最佳酶解方案

用SAS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，求得甲魚(yú)蛋白水解的最佳酶解方案為：酶用量在1.318水平（14350.77 U/kg），作用溫度在 1.318水平（69℃），pH在-0.682水平（7.30），作用時(shí)間在-1.682水平（7 h）。此酶解方案得出的甲魚(yú)蛋白的最佳水解度可達(dá)19.53%。

3 討論

二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)是一種具有正交、回歸、均勻和較高飽和程度的一種試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，屬更高級(jí)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)技術(shù)。它具有兩個(gè)顯著的優(yōu)點(diǎn)：一、基本保留了回歸正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)次數(shù)少、計(jì)算簡(jiǎn)單以及部分地消除了回歸系數(shù)間的相關(guān)性的優(yōu)點(diǎn)；二、克服了在回歸正交設(shè)計(jì)中二次回歸預(yù)測(cè)值的方差依賴(lài)于試驗(yàn)點(diǎn)在因子空間中位置的缺點(diǎn)[14]。本試驗(yàn)通過(guò)二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)得到木瓜蛋白酶水解甲魚(yú)蛋白的最佳酶解工藝參數(shù)，通過(guò)此酶解方案得出的甲魚(yú)蛋白的最佳水解度可達(dá)19.53%，其結(jié)果顯著高于殷金蓮[15]等的報(bào)道。

本次試驗(yàn)中使用改進(jìn)的氨基態(tài)氮的測(cè)定方法，借助精密pH計(jì)，能避免雙指示劑甲醛滴定法測(cè)定時(shí)，由眼睛色差所引起的的誤差。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，甲魚(yú)原料處理的差異、試驗(yàn)方法的不同以及甲魚(yú)品種之間的差異，均會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。

另外在酶解蛋白質(zhì)的過(guò)程中能夠獲得許多功能多肽，這些多肽對(duì)于我國(guó)生物醫(yī)藥和保健制品的開(kāi)發(fā)，以及提高人類(lèi)的健康水平具有重要意義[16-18]。Suetsuna-K[19]等利用酶水解沙丁魚(yú)，從中得到抗氧化肽，徐懷德[20]對(duì)木瓜蛋白酶水解甲魚(yú)蛋白酶解產(chǎn)物進(jìn)行體外ACE抑制和抗氧化活性研究，證實(shí)甲魚(yú)多臺(tái)具有較強(qiáng)的體外ACE抑制活性和抗氧化活性。本試驗(yàn)只是對(duì)木瓜蛋白酶水解甲魚(yú)蛋白的參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，兩種或3種酶結(jié)合水解的效果是否會(huì)更好[21]，以及甲魚(yú)酶解液的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和產(chǎn)品的功能性等，目前還存在爭(zhēng)議，有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

通過(guò)運(yùn)用二次回歸旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合，建立了甲魚(yú)蛋白的水解度對(duì)酶用量、酶解溫度、pH及酶解時(shí)間4個(gè)試驗(yàn)因素的正交回歸模型，得出了木瓜蛋白酶水解甲魚(yú)蛋白的最佳酶解工藝條件。試驗(yàn)結(jié)果表明，在pH 7.30，溫度69℃的條件下，用14350.77 U/kg的木瓜蛋白酶水解甲魚(yú)蛋白7 h，甲魚(yú)蛋白的水解度最高可達(dá)19.53%。

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The Optimal Parameters for Turtle Protein Enzymatic Hydrolysis by Papain

ZHANG Xiao-xu1,ZHAO Guo-qi1,*,QIAN Li-chun2,CAO Chong-hai2

（1.College of Animal Science and Technology，Yangzhou University，Yangzhou 225009，Jiangsu,China；2.Feed Science Institute，Zhejiang University，Hangzhou 310029，Zhejiang,China）

Four single-factors（enzyme concentration,temperature,pH and time）for turtle protein enzymatic hydrolysis by papain were studied in this paper.By means of quadratic regression rotational combinational design,effect of four factors on the degree of hydrolysis of turtle protein were studied,a mathematical model of protein hydrolysis was established and an optimum parameters for turtle protein enzymatic hydrolysis.According to their influence on the yield of protein hydrolysis,the result showed that the ranking of the factors was enzyme concentration>pH>time>temperature.The optimum parameters for turtle protein enzymatic hydrolysis by papain was as following:the enzyme concentration 14350.77 U/kg,temperature 69℃,pH 7.30 and time 7 h.Under such condition,the degree of hydrolysis can come up to 19.53%.

papain;turtle protein;quadratic regression rotational combinational design;optimization

浙江省重大科技專(zhuān)項(xiàng)（2008C12023-2）

張曉旭（1983—），女（漢），碩士，研究方向：動(dòng)物微生態(tài)營(yíng)養(yǎng)與分子營(yíng)養(yǎng)。

*通信作者：趙國(guó)琦，男，教授（博導(dǎo)），博士，研究方向：動(dòng)物微生態(tài)營(yíng)養(yǎng)與分子營(yíng)養(yǎng)。

2010-08-01